CRISPR) es una técnica de edición del genoma de tercera generación: CRISPR revolucionó el mundo.

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente (CRISPR) son una técnica de edición genómica de tercera generación que ha revolucionado el mundo con sus resultados de alto rendimiento. Se ha utilizado para tratar diversas enfermedades e infecciones biológicas. Varias bacterias y otros procariotas (como las arqueas) también poseen sistemas CRISPR/Cas9 para defenderse de los fagos. Se ha informado que las estrategias basadas en CRISPR/Cas9 pueden inhibir el crecimiento y la progresión del cáncer de mama triple negativo (CMTN) al dirigirse a genes de resistencia, transcripción y regulación epigenética potencialmente alterados. Estas intervenciones terapéuticas pueden ayudar a abordar problemas complejos como la resistencia a los fármacos observada incluso en el CMTN. Actualmente, se utilizan diversos métodos para administrar CRISPR/Cas9 a las células diana, como métodos físicos (microinyección, electroporación y métodos hidrodinámicos), virales (virus adenoasociados y lentivirus) y no virales (liposomas y nanopartículas lipídicas). Aunque se han desarrollado diversos modelos para estudiar las causas moleculares del cáncer de mama triple negativo (CMTN), la falta de métodos sensibles y específicos para la administración in vivo de herramientas de edición genómica limita su aplicación clínica. En resumen, esta revisión examina exhaustivamente el progreso, los desafíos, las limitaciones y las perspectivas del tratamiento con CRISPR/Cas9 para el CMTN, basándose en la evidencia existente. Asimismo, destacamos cómo la combinación de inteligencia artificial y aprendizaje automático puede mejorar las estrategias con CRISPR/Cas9 en el tratamiento del CMTN.
El cáncer se caracteriza por la división celular descontrolada, la alteración de los puntos de control del ciclo celular y mutaciones en genes supresores de tumores (GST) (Matthews et al., 2022). Entre los diferentes tipos de cáncer, el cáncer de mama es el más común en mujeres y presenta una alta tasa de mortalidad a nivel mundial (Waks y Winer, 2019). El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea con características diversas, como rasgos histológicos y biológicos, presentación clínica y comportamiento, y respuesta al tratamiento (Weigelt et al., 2010). La clasificación del cáncer de mama proporciona información precisa para el diagnóstico y el pronóstico del tumor. El uso de biomarcadores comunes y características clinicopatológicas ha sido el criterio principal para la clasificación del cáncer de mama (Tsang y Tse, 2019). El pronóstico y la respuesta al tratamiento del cáncer de mama están influenciados por numerosos factores, incluyendo la presencia del receptor de estrógeno (RE), el receptor de progesterona (RP), el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2/neu), y el grado histológico, el tipo de tumor, el grado, el tamaño y la metástasis en los ganglios linfáticos (Al-Tubaiti, 2020). Se han identificado cinco subtipos moleculares intrínsecos de cáncer de mama, incluyendo luminal A, luminal B, HER2-enriquecido, basal-like y claudina-low (Prat et al., 2015). El TNBC es un subtipo molecular de cáncer que no expresa todos los RE, RP y HER2 (Yin et al., 2020). Estas características patológicas están asociadas con el TNBC, confirmando su rápida progresión y naturaleza más agresiva que cualquier otro tipo de cáncer de mama (Feng et al., 2018). Además, Peru et al. (2000) utilizaron tecnología de microarrays para reclasificar el cáncer de mama e identificar cinco subtipos intrínsecos de cáncer de mama (Cadenas, 2012). El cáncer de mama basal es un subtipo de cáncer de mama que tiene un fenotipo triple negativo y se asocia con una rápida progresión. Cabe señalar que todos los cánceres de mama basales se diagnostican erróneamente como TNBC, pero solo el 77% son TNBC; en contraste, entre el 71% y el 91% de los TNBC son basales, lo que indica que estos dos tipos de cáncer de mama se superponen y representan clasificaciones diferentes (Wang D.-Y. et al., 2019). Esto crea la necesidad de caracterizar la heterogeneidad del TNBC para dilucidar el pronóstico e identificar posibles respuestas a los tratamientos actuales y futuros. Además, el TNBC representa entre el 15% y el 20% de todos los casos de cáncer de mama y es más común en mujeres menores de 50 años. Se han reportado mutaciones en BRCA1 o BRCA2 en aproximadamente el 20% de los casos de TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Los estudios también han demostrado que el TNBC tiene un microambiente inmunitario distintivo que incluye altos niveles de factores de crecimiento endotelial vascular, macrófagos asociados a tumores (TAM), linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y otras moléculas involucradas en el crecimiento y la migración tumoral. Por lo tanto, comprender el microambiente del TNBC es fundamental para su pronóstico y tratamiento (Fan y He, 2022).
Para evaluar el pronóstico del cáncer de mama triple negativo (CMTN) y garantizar un tratamiento eficaz, es importante un diagnóstico preciso, basado principalmente en la inmunohistoquímica (IHQ) para detectar ER, PR y HER2, y la mamografía para detectar neoplasias mamarias. Sin embargo, la mamografía no puede mostrar adecuadamente características intratumorales como la necrosis y la fibrosis (Deepak Singh et al., 2021). Dado que un mal pronóstico y un diagnóstico deficiente impiden a los médicos prescribir los medicamentos adecuados (Chaudhary, 2020), se utilizan diversas estrategias para mejorar la atención de las pacientes con CMTN. Actualmente, dos fármacos, la doxorrubicina y la ciclofosfamida, se utilizan en pacientes con CMTN y han demostrado buenos resultados. Además, se utilizan otros fármacos de platino, como el carboplatino y el cisplatino (Sikov et al., 2015). Además, los inhibidores de PARP como Olaparib, Velaparib y PF-01367338 se han utilizado como posibles fármacos quimioterapéuticos para el tratamiento del TNBC (Ishino et al., 2018). Dado que se ha informado que las vías de señalización Wnt/β-catenina, NOTCH y Hedgehog están involucradas en la aparición y progresión del TNBC, dirigir los fármacos a estas vías puede ser una estrategia importante (Aysola et al., 2013). Aunque la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia siguen siendo el pilar del tratamiento para el TNBC en la actualidad, se han logrado avances significativos en el desarrollo de nuevos tratamientos que incluyen la terapia dirigida, la inmunoterapia, varias herramientas de edición genética relacionadas con CRISPR como Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, edición primaria y terapia génica dirigida con CRISPR/Cas9. Aquí nos centraremos en varias herramientas de edición genética relacionadas con CRISPR utilizadas en el tratamiento del TNBC. Entre ellas, CRISPR/Cas9 ha recibido una gran atención.
Cas9n, también conocida como Cas9 nickasa, es una variante genéticamente modificada de la proteína Cas9 derivada del sistema de edición genómica CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). En su forma original, la proteína Cas9 contiene dos dominios nucleasa: RuvC y HNH, cuya función principal es la escisión de ambas hebras de ADN. Sin embargo, en Cas9n, uno de los dominios nucleasa, HNH, está mutado genéticamente y se vuelve inactivo. Por lo tanto, el dominio HNH de Cas9n permanece inactivo. Solo el dominio RuvC permanece activo, lo que permite a Cas9n cortar o crear rupturas en hebras de ADN individuales (Trevino y Zhang, 2014). En comparación con Cas9, Cas9n puede reducir eficazmente los efectos fuera de objetivo y mejorar con precisión los mecanismos de reparación celular. Cas9n puede utilizarse para resolver diversos problemas, como la creación de rupturas en ubicaciones específicas del ADN de doble hebra. Para este propósito, se combinaron dos moléculas de Cas9n y se utilizaron juntas (Yee, 2016). La quinasa de linaje mixto 3 (MLK3) es una proteína quinasa activada por mitógenos que actúa como un regulador clave durante la metástasis del TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 puede activar múltiples vías de señalización que conducen a la metástasis del TNBC. Por ejemplo, la vía de la cinasa N-terminal de c-Jun (JNK) regula la motilidad celular y la degradación de la matriz extracelular, y MLK3 activa la vía JNK, lo que aumenta la motilidad celular y confiere propiedades invasivas (Rattanasinchai y Gallo, 2016). MLK3 también regula la EMT. Para ello, activa factores de transcripción posteriores como Snail, Slug y Twist. Estos factores inhiben la expresión de marcadores epiteliales y promueven la expresión de marcadores mesenquimales, lo que conduce a la adquisición de un fenotipo metastásico (Casalino et al., 2023). Se ha observado que MLK3 desempeña un papel en la remodelación de la ECM y la activación de proteasas como las metaloproteinasas de matriz (MMP) que degradan la ECM. Esto facilita la invasión de las células tumorales y su diseminación a sitios distantes (Katari et al., 2019). Así, estudios previos han demostrado que MLK3 desempeña un papel fundamental en el cáncer de mama triple negativo (TNBC). Rattanasinchai y Gallo utilizaron modelos de TNBC para estudiar la función de MLK3 y descubrieron que promueve el desarrollo del cáncer a través de vías de señalización específicas. Emplearon CRISPR/Cas9n para editar MLK3 y observaron una reducción significativa de la metástasis en el TNBC (Rattanasinchai y Gallo, 2016).
dCas9, a menudo denominada Cas9 inactiva, es una forma derivada modificada de la proteína Cas9. A diferencia de la Cas9 activa, dCas9 carece de actividad endonucleasa, lo que le impide inducir rupturas de doble cadena en el ADN. Por lo tanto, dCas9 puede utilizarse para dirigirse con precisión a regiones específicas del genoma sin alterar la secuencia de ADN (Wang et al., 2016). En dCas9, dos proteínas endonucleasas, RuvC y HNH, se inactivan al suprimir residuos de aminoácidos importantes (Richter et al., 2016). A pesar de su falta de actividad de corte de ADN, dCas9 desempeña diversas funciones importantes en la investigación genética y la biotecnología. Por ejemplo, permite visualizar regiones específicas del genoma, facilita la regulación transcripcional y promueve modificaciones epigenéticas (Brocken et al., 2018).
El factor de transcripción ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) desempeña un papel específico y crucial en la mediación de la transición epitelio-mesenquimal (TEM), un proceso celular que ocurre durante el desarrollo embrionario, la reparación tisular y la progresión del cáncer. Implica la transformación de células epiteliales en células mesenquimales, lo que resulta en cambios en la morfología celular, la motilidad, la invasividad, etc. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibe múltiples marcadores epiteliales, como la E-cadherina y la ocludina, que son responsables de mantener la adhesión célula-célula y la polaridad de las células epiteliales en el cáncer de mama triple negativo (Moreno-Bueno et al., 2008). Además, ZEB1 activa ciertos marcadores como N-cadherina, vimentina y fibronectina (Konradi et al., 2014) y también regula genes involucrados en la remodelación del citoesqueleto como las GTPasas Rho y las metaloproteinasas de matriz (MMP) (Huang). et al., 2014). 2022), además, también afecta varias vías de señalización como el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), la señalización Wnt, etc., promoviendo así la invasión tumoral y la metástasis en TNBC (Chen et al., 2016). ). Numerosos estudios y evidencia científica indican que ZEB1 tiene un gran potencial como un agente valioso para la detección y la intervención terapéutica de TNBC. En un estudio reciente, Waryah et al. utilizaron un modelo de TNBC y lograron la supresión completa de ZEB1 por dCas9. Así, observaron una especificidad muy alta y una inhibición casi completa de ZEB1 en condiciones in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 es una herramienta de edición genética denominada CRISPR/Cpf1. Se deriva del sistema CRISPR/Cas, donde el término Cas12 se refiere a la proteína 12 asociada a CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), que es completamente similar a Cas9. La única diferencia es que contiene la proteína Cas12. En comparación con Cas9, Cas12 posee funciones únicas, como la generación de extremos cohesivos durante el proceso de edición genética, mientras que Cas9 genera extremos romos (Wang et al., 2021). Esta propiedad de Cas12 contribuye a su tecnología específica de manipulación de ADN. Como proteína capaz de reconocer y cortar con precisión el ADN objetivo, posee una versatilidad extraordinaria, lo que la convierte en una herramienta eficaz para diversas aplicaciones, incluida la edición genética (Pickar-Oliver y Gersbach, 2019).
Al igual que otras variantes de CRISPR, CRISPR/Cas12 también es capaz de inactivar o activar genes en el cáncer de mama triple negativo (TNBC), centrándose en genes que desempeñan un papel importante en su patogénesis o respuesta al tratamiento (Yang y Zhang, 2023). Para lograr este proceso, se desarrolló un ARN guía (ARNg) que dirige a Cas12 al gen diana. Una vez que Cas12 se une a su diana, introduce rupturas de doble cadena en el ADN y activa los mecanismos de reparación del ADN. Durante el proceso de reparación, pueden incorporarse nucleótidos incorrectos, lo que provoca mutaciones genéticas y pérdida de función (Zhang et al., 2021a). Además, también se utilizó una versión mejorada de la enzima Cas12 (denominada dCas12) para activar genes. Al combinarla con un activador de la transcripción, es posible inducir ciertos genes, activándolos. Esta tecnología tiene un gran potencial para promover la activación de genes supresores de tumores (Sultan et al., 2022).
La edición de cebadores es una tecnología de edición genómica de reciente desarrollo y extremadamente avanzada. Es capaz de modificar el ADN de un organismo con gran precisión (Chen y Liu, 2023). La edición de cebadores se logra mediante la integración de dos componentes principales: una enzima CRISPR/Cas9 modificada y una transcriptasa inversa. La función de la enzima CRISPR/Cas9 es dirigirse selectivamente a sitios precisos del genoma, mientras que la transcriptasa inversa ayuda a modificar completamente el ADN en la ubicación objetivo (Hassan et al., 2021). En el mecanismo de edición de cebadores, el primer paso implica la creación de un ARN guía de edición de cebadores (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Este contiene la secuencia objetivo y la plantilla de ARN correspondiente al sitio de edición deseado en el ADN objetivo. El pegRNA se introduce en las células objetivo junto con una nucleasa de edición de cebadores (PE2). PE2 es una proteína de fusión que consta de una enzima Cas9, una transcriptasa inversa y un adaptador de edición de cebadores (Martín-Alonso et al., 2021). Dentro de la célula, los complejos pegRNA y PE2 buscan el ADN específico que desean modificar. La enzima Cas9 corta el ADN y crea una plantilla compuesta por cadenas simples (Choi et al., 2022). La transcriptasa inversa utiliza esta plantilla para preparar el ADN para la edición. Junto con la copia del ADN, también se incluyen instrucciones para editar la plantilla de ARN. Finalmente, la cadena de ADN recién creada se utiliza como plantilla para reparar la rotura en el ADN, lo que da como resultado una secuencia de ADN alterada que contiene la modificación deseada (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Los mecanismos de edición de cebadores pueden provocar mutaciones generalizadas en los genes. Pueden dirigirse a mutaciones puntuales, inserciones, deleciones e incluso reemplazos de genes (Anzalone et al., 2019; Chen y Liu, 2023). La edición de cebadores ofrece varias ventajas sobre las tecnologías de edición genómica anteriores. Estas incluyen una mayor precisión, una reducción de los efectos fuera de objetivo y la capacidad de editar el ADN sin depender de roturas de doble cadena de ADN (Anzalone et al., 2020).
La tecnología CRISPR/Cas9 se desarrolló originalmente para proteger a las bacterias de la transferencia de plásmidos y la infección por fagos, y posteriormente se reutilizó como una herramienta eficaz de edición genómica basada en ARN para la edición de ADN (Jiang y Doudna, 2017). Además, se ha informado que el sistema CRISPR/Cas9 está presente en el 50 % y el 87 % de los genomas bacterianos y arqueales, respectivamente (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 es una herramienta potencial para la eliminación, inserción y corrección de cualquier secuencia genética anormal mediante métodos in vivo e in vitro (Sabit et al., 2021). Asimismo, se ha demostrado que CRISPR/Cas9 forma parte del sistema inmunitario adaptativo debido a su especificidad para los genes diana de interés (Chen y Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 consta de Cas9 y un ARN guía simple (sgRNA). Cas9 es una endonucleasa compuesta por múltiples componentes proteicos. Además, Cas9 tiene propiedades estructurales y conformacionales únicas (Pacesa et al., 2022) ya que consta de dos lóbulos: reconocimiento (REC) y nucleasa (NUC). El lóbulo REC se divide a su vez en tres regiones: REC1, REC2 y hélices puente (Cromwell et al., 2018). El NUC consta de tres lóbulos, a saber, RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH y el dominio de interacción del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). El sgRNA consta de dos componentes, que incluyen el ARN CRISPR (crRNA) y el ARN pequeño transcodificador (ARN trazador) (Figura 1). El sgRNA conecta la proteína Cas9 con las conexinas para formar un complejo activo, también conocido como complejo efector (Richter et al., 2012). El crRNA es un par de bases de 18 a 20 nucleótidos que desempeña un papel crítico en el reconocimiento de secuencias de ADN diana. Además, el crRNA se aparea con el ADN diana, y el tracrRNA actúa como andamio para que la nucleasa Cas9 se una al ADN diana (Manghwar et al., 2019). Por otro lado, la secuencia PAM tiene 3 nucleótidos, que confirman, especifican y median la unión del complejo efector al ADN. Las subunidades RuvC y HNH del complejo proteico Cas9 tienen actividad catalítica (Richter et al., 2012; Asmamaw y Zawdie, 2021). El dominio nucleasa HNH de la subunidad Cas9 corta la cadena de ADN asociada al crRNA. El dominio nucleasa RuvC corta otras hebras de ADN y genera roturas de doble hebra (DSB), después de lo cual se activan dos mecanismos diferentes de reparación de roturas de ADN (Jiang y Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Descripción general de CRISPR/Cas9 (A). Componentes del sistema CRISPR/Cas9: (i). La endonucleasa Cas9 es responsable de cortar la secuencia de ADN objetivo, (ii) un ARN guía simple (sg) resultante de la fusión de quimeras crRNA y tra-crRNA. (dos). Cas9 incluye varios componentes como Rec I, Rec II, el lóbulo NUC (HNH y Ruv C son subcomponentes) y el dominio de interacción PAM (C) con funciones correspondientes. El complejo proteico CRISPR/Cas9 corta las secuencias de ADN en formas no complementarias y complementarias (D). CRISPR/Cas9 edita el genoma en tres etapas: reconocimiento, corte y reparación. El sg-RNA diseñado guía a Cas9 y reconoce la secuencia deseada a través del componente complementario crRNA. Cas9 reconoce la secuencia PAM en 5′-NGG-3′ y desnaturaliza el ADN, formando un híbrido ADN-ARN y activando el corte. El dominio HNH de Cas9 corta la hebra complementaria, y el dominio RuvC corta la hebra no complementaria. CRISPR/Cas9 repara el ADN bicatenario rompiéndolo de dos maneras: unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ repara el ADN bicatenario en ausencia de ADN homólogo extraño mediante un proceso enzimático, un mecanismo propenso a errores que puede insertar o eliminar secuencias de ADN aleatorias. HDR es muy específico y requiere plantillas de ADN homólogas.
Las vías de reparación mediadas por CRISPR/Cas9 incluyen los mecanismos de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ es una vía propensa a errores porque implica inserción o deleción y no requiere ningún patrón durante el mecanismo de reparación. Utiliza nucleótidos aleatorios para generar proteínas estándar (Abbasi et al., 2021). Este sistema de reparación consta de cuatro complejos como el complejo KU, el complejo de proteína de complementación cruzada tipo 4 (XRCC-4), la enzima de procesamiento de extremos de ADN y la proteína quinasa DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). La proteína del complejo KU tiene dos subunidades, Ku 70 y Ku 80, y juega un papel importante en el mecanismo NHEJ, ya que el mecanismo de reparación se inicia por la unión de dos subunidades (Ku 70 y Ku 80) a los extremos romos o casi romos del ADN diana (Abbasi et al., 2021), sirviendo como andamio para reclutar otros factores relacionados con NHEJ al sitio de la lesión (Yang et al., 2020). XRCC-4 y la ADN ligasa están compuestas por 334 y 911 aminoácidos, respectivamente, y el complejo XRCC4-ADN ligasa IV estimula la ligación de los extremos del ADN (Chatterjee et al., 2015). La enzima de procesamiento de extremos de ADN, también conocida como polinucleótido quinasa 3′-fosfato, es una enzima de procesamiento de extremos de ADN. Puede eliminar el grupo 3′P en el ADN y fosforilar el grupo 5′OH durante la reparación de DSB. También implica la reparación de roturas de cadena simple (SSB) utilizando la vía de reparación de SSB (Chatterjee et al., 2015). La proteína quinasa DNA-PKcs es una proteína quinasa dependiente de ADN que consta de una subunidad catalítica de la familia PIKK (quinasas relacionadas con la fosfatidilinositol 3-quinasa) y ATM (ataxia telangiectasia mutada), así como ATM y ATR relacionados con Rad3. roturas de cadena simple (DSB) y roturas de cadena simple (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
La reparación por recombinación homóloga (HDR) es un mecanismo de reparación más preciso y adecuado, ya que la información se copia utilizando la forma intacta del dúplex de ADN homólogo, aunque requiere la presencia de cromátidas hermanas. Esto ocurre durante la fase S/G2 del ciclo celular de los mamíferos. La HDR se produce principalmente en especies de levadura, pero la unión de extremos no homólogos (NHEJ) es fundamental en mamíferos (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). El mecanismo de reparación completo se muestra en la Figura 1.
Dado que el TNBC es causado por anomalías genéticas y epigenéticas, la corrección de anomalías genómicas/epigenómicas malignas mediante CRISPR/Cas9 puede ser un enfoque terapéutico razonable (Chen et al., 2019). Además, algunos factores de transcripción involucrados en la regulación transcripcional específica de células pueden exhibir características únicas de las células cancerosas, lo que sugiere que la regulación transcripcional puede ser un excelente enfoque para el tratamiento del cáncer (Drost et al., 2017). Explotar estas características moleculares de los tumores, como defectos genéticos, epigenéticos y transcripcionales, para el desarrollo de fármacos puede mejorar los resultados clínicos y reducir los costos de detección. CRISPR es una herramienta potencial de edición genética que no solo puede detectar e identificar objetivos genómicos causantes de cáncer, sino que también puede usarse para editar, suprimir y modificar epigenéticamente oncogenes en células humanas (Tabla 1) (Ahmed et al., 2021). Se han realizado varias pruebas de CRISPR para buscar genes asociados con supresores de tumores, oncogenes y resistencia a fármacos. En la figura 2 se muestra el uso de CRISPR/Cas9 para editar varios oncogenes del cáncer de mama triple negativo (TNBC).
Figura 2. Edición genética de varios oncogenes de TNBC mediante CRISPR/Cas9, lo que resulta en una reducción del crecimiento tumoral y la metástasis. Estos oncogenes incluyen CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 y CXCR7, Crypto1, ROR1 y ST8SIA, que participan en la aparición y metástasis del TNBC.
La migración, invasión y transición epitelio-mesenquimal (EMT) de las células cancerosas están asociadas con ITGA9. Estudios previos han demostrado que ITGA9 es un actor clave en la vía Notch y desempeña un papel interesante en la metástasis del rabdomiosarcoma (Molist et al., 2020). Además, se encontró que ITGA9 está estrechamente asociado con el pronóstico del paciente en varios tipos de tumores, incluido el cáncer de mama (Wang Z. et al., 2019). Asimismo, el análisis bioinformático de ITGA9 mostró que su expresión en el cáncer de mama triple negativo (TNBC) era significativamente mayor que en otros subtipos de cáncer de mama. Los niveles elevados de ITGA9 están asociados con la metástasis tumoral y la recidiva en pacientes con TNBC. La eliminación de ITGA9 mediante CRISPR/Cas9 resultó en propiedades similares a las de las células madre cancerosas (CSC), angiogénesis tumoral, crecimiento tumoral y metástasis reducida al promover la degradación de β-catenina en TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 es un miembro de la familia TGF-β y es fundamental para la embriogénesis temprana, el mantenimiento de células madre y la metástasis del cáncer (Ishii et al., 2021). También conocido como Tdgf-1, es una proteína de señalización oncogénica anclada a GPI involucrada en la regulación de la formación de la línea primitiva, el mesodermo y el endodermo, así como en el establecimiento de la asimetría izquierda/derecha en el desarrollo de los órganos corporales durante la embriogénesis (Zhang et al., 2021b). Además, se ha demostrado que Cripto-1 está involucrado en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) como un marcador de células madre (Zhang et al., 2021b). La EMT es fundamental no solo para varios procesos como el desarrollo embrionario, la fibrosis y la cicatrización de heridas, sino también para la invasión y metástasis del cáncer. Además, se ha demostrado que Crypto-1 interactúa con cuatro receptores Notch y potencia su maduración postraduccional (Brandstadter y Maillard, 2019). Se sabe que la vía de señalización Notch participa en el mantenimiento de las células de cáncer de mama humano. Diversos estudios han demostrado que la eliminación de Crypto-1 mediante CRISPR/Cas9 suprime el crecimiento y la metástasis del cáncer. Por lo tanto, Crypto-1 podría convertirse en una importante diana terapéutica para el cáncer de mama triple negativo (Castro et al., 2015).
La proteína XCL12 y su receptor de quimiocina CXC (CXCR4 y CXCR7) desempeñan diversas funciones en la proliferación, crecimiento, migración e invasión de células cancerosas (Wu et al., 2015). Estos quimiorreceptores se han asociado con el desarrollo de TNBC a través de múltiples vías de señalización tanto en modelos in vivo como in vitro (Wu et al., 2015). Además, la activación de CXCR4 y CXCR7 se asocia con una mayor susceptibilidad a la metástasis y un mal pronóstico en TNBC (Karn et al., 2022). Por lo tanto, la eliminación de CXCR4 y CXCR7 puede convertirse en genes diana farmacológica eficaz para el tratamiento del cáncer de mama, incluido el TNBC. Estudio de Yang et al. Yang et al (2019) utilizaron CRISPR/Cas9 para eliminar simultáneamente los genes CXCR4 y CXCR7 y descubrieron que la proliferación, el crecimiento, la migración y la invasión del TNBC se inhibieron significativamente (Yang et al., 2019).
Se observaron niveles elevados de miR-3662, un oncogén del cáncer de mama triple negativo (TNBC), en tejidos de cáncer de mama (Yi et al., 2022). Se ha demostrado que la inhibición de miR-3662 frena el crecimiento tumoral y la metástasis del cáncer de mama tanto in vivo como in vitro (Agarwal y Gupta, 2021). HBP-1 es un potente inhibidor de la señalización Wnt/β-catenina y probablemente sea responsable del crecimiento de las células TNBC mediado por miR-3662. Recientemente, Yi et al. descubrieron que el eje miR-3662-HBP1 regula la vía de señalización Wnt/β-catenina en células TNBC (Yi et al., 2022). Debido a su expresión específica en tumores, miR-3662 podría ser una diana terapéutica potencial para el TNBC. Por lo tanto, la inhibición de miR-3662 mediante CRISPR/Cas9 podría ser un excelente enfoque para el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento del TNBC.
UBR5 es una nucleofosfoproteína de 300 kDa que se ha identificado como un regulador clave de la tumorigénesis, la metástasis y la respuesta inmune en varios cánceres (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Se ha informado que UBR5 está altamente sobreexpresada en muestras de TNBC y estimula la función de ERα al inducir la proliferación a través de su actividad de ubiquitina ligasa (Bolt et al., 2015). Los estudios de secuenciación del exoma completo de muestras primarias de TNBC también mostraron una mayor expresión de UBR5, lo que sugiere su papel en el desarrollo de TNBC. Además, la deleción de UBR5 impulsada por CRISPR/Cas9 mostró una inhibición significativa de la metástasis y el crecimiento de TNBC en modelos experimentales de ratón. Además, la inclusión de UBR5 en un modelo de ratón de tipo silvestre restauró su funcionalidad completa, mientras que este efecto no se observó en cepas mutantes inactivadas (Liao et al., 2017). La falta de UBR5 se asocia con un aumento de la apoptosis, la necrosis y la inhibición del crecimiento tumoral en TNBC debido a una angiogénesis deficiente. Debido a la pérdida de UBR5, la propagación tumoral a órganos distantes se reduce, y UBR5 induce una EMT anormal principalmente al reducir la expresión de E-cadherina (Zhang y Weinberg, 2018). Recientemente, se demostró que UBR5 es un factor muy importante en la transcripción de PDL1 inducida por IFN-γ en TNBC debido a su falta de actividad de ubiquitinación E3. El análisis del transcriptoma de ARN reveló que UBR5 puede tener efectos sistémicos en genes asociados con la vía de IFN-γ y promover la transactivación de PDL1 al aumentar los niveles de activación de la proteína quinasa ARN (PKR) y sus transductores y activadores de señales, transcripción 1 (STAT1) y factor regulador de interferón 1 (IRF1). Sin embargo, la ablación combinada de la expresión de UBR5 y PD-L1 mediante CRISPR/Cas9 tiene un efecto terapéutico sinérgico mayor que el de cualquiera de los bloqueos por separado, con profundos efectos en el microambiente tumoral (Wu et al., 2022). Por lo tanto, CRISPR/Cas9 podría ser una herramienta importante para inhibir la función de UBR5, suprimiendo así la metástasis y el crecimiento tumoral del cáncer de mama triple negativo.
ROR1 es una proteína transmembrana de tipo I que se expresa durante el cáncer y el desarrollo embrionario y se ha identificado como una proteína oncofetal (Nicholas Borcherding, 2014). El comportamiento invasivo de varios cánceres humanos se asocia con la sobreexpresión de ROR1. Se han obtenido resultados prometedores de estudios in vivo e in vitro con compuestos terapéuticos dirigidos a ROR1 (Chien et al., 2016). Los niveles elevados de ARNm de ROR1 en biopsias de tejido mamario también se han asociado con tumores mamarios basales agresivos (BL) y su migración a otras partes del cuerpo. Además, la sobreexpresión de ROR1 se ha identificado como un marcador pronóstico para el desarrollo de TNBC (Chien et al., 2016). Sin embargo, silenciar ROR1 mediante CRISPR/Cas9 para suprimir el crecimiento y la metástasis de TNBC sería una estrategia eficaz.
El proceso de sialilación implica la adición de ácido siálico a los glicoconjugados, catalizada por sialiltransferasas (ST). ST8SIA1 pertenece a la familia ST y desempeña un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades, como la leucemia linfocítica y el cáncer colorrectal (Chang et al., 2018). El análisis de la secuencia de ARN muestra que ST8SIA1 se expresa en altos niveles en el tejido mamario de pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC) y se correlaciona positivamente con mutaciones en el gen supresor de tumores p53, lo que podría contribuir a la patogénesis del TNBC (Battula et al., 2017). Además, ST8SIA1 está implicada en la metástasis y la recurrencia del TNBC, lo que sugiere que desempeña un papel importante en su aparición y desarrollo. En un modelo in vitro de TNBC, se demostró que la inhibición de ST8SIA1 mediante CRISPR/Cas9 bloquea el crecimiento y la metástasis (Battula et al., 2017). Esto sugiere que CRISPR/Cas9 podría ser una herramienta importante para inhibir la función del oncogén ST8SIA1 en el tratamiento del cáncer de mama triple negativo.
NAT1 es una enzima metabólica que cataliza la formación de compuestos xenobióticos de fase II y se expresa en casi todos los tejidos humanos. NAT1 puede utilizar el cofactor folato para actuar sobre el acetil-CoA (acetil-CoA) incluso en ausencia del sustrato de amina aromática (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Estudios han demostrado que NAT1 regula la función de la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9) en modelos de células de cáncer de mama y protege contra las especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la privación de glucosa (Wang et al., 2018). Se ha demostrado que la eliminación de NAT1 inhibe el complejo piruvato deshidrogenasa, lo que conduce a disfunción mitocondrial (Wang L. et al., 2019). Además, varios informes han demostrado que la inhibición de NAT1 mediante moléculas pequeñas y silenciamiento con siRNA puede reducir la invasividad y proliferación de células de cáncer de mama (Stepp et al., 2018). Recientemente, se utilizó CRISPR/Cas9 para suprimir NAT1 en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231, lo que afectó el metabolismo celular según su nivel de expresión. Este estudio también demostró que NAT-1 es fundamental para la progresión y la metástasis del cáncer de mama triple negativo (Carlisle et al., 2020).
La transcripción coordinada de oncogenes está regulada por superpotenciadores, factores de transcripción y cofactores (Hnisz et al., 2015). Además, un grupo de quinasas dependientes de ciclinas (CDK), como CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 y CDK13, son necesarias para la regulación transcripcional. Entre ellas, CDK7 participa en la fosforilación de la ARN polimerasa II, lo cual es fundamental para el inicio y la expansión de la transcripción de oncogenes en la patogénesis del cáncer de mama triple negativo (TNBC). En un estudio pionero, la eliminación de CDK7 mediante CRISPR/Cas9 inhibió el TNBC, lo que indica que la patogénesis de este cáncer depende de CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Estudios han demostrado que las mutaciones en MYC y RBP (proteína de unión a ARN) pueden conducir a la apoptosis, mientras que las mutaciones de un solo gen en MYC o RBP no afectan el crecimiento de las células cancerosas (Einstein et al., 2021). Se han examinado más de 1000 RBP en el genoma humano utilizando una biblioteca basada en CRISPR/Cas9. Entre ellas, se encontró que 57 RBP son críticas para el crecimiento de células cancerosas con niveles muy elevados de MYC (Wheeler et al., 2020). Además, YTHDF2 es importante para mantener el crecimiento de células TNBC y reduce la cantidad de transcritos metilados durante la transcripción y traducción de alto nivel en células cancerosas con mayor expresión de MYC. Adicionalmente, YTHDF2 no es esencial para las células cancerosas, que son menos dependientes de niveles elevados de MYC para prolongar la supervivencia de pacientes con TNBC (Einstein et al., 2021), lo que sugiere que puede ser una diana terapéutica potencial para fármacos que pueden vencer el TNBC.
Las proteínas de dedos de zinc (ZNF) constituyen aproximadamente el 1 % del genoma humano total. Diversos estudios han demostrado que las ZNF pueden regular la proliferación celular en distintos tipos de cáncer, como el de hígado, mama y colorrectal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Se han utilizado bibliotecas generadas mediante la técnica CRISPR knockout para analizar diversos genes supresores de tumores (TSG) en células de cáncer de mama (Shalem et al., 2014). Posteriormente, un estudio transcriptómico de células de cáncer de mama con deleción de ZNF319 mediante CRISPR/Cas9 ha demostrado que ZNF319 es un gen supresor de tumores que reduce la proliferación del cáncer de mama y, por lo tanto, participa en diversos mecanismos de señalización potenciales y otras funciones biológicas (Wang L. et al., 2022).
La ferroptosis es un tipo de muerte celular programada que depende de la presencia de hierro. Se sabe que el desarrollo de la ferroptosis está influenciado por la presencia de peróxidos lipídicos. Además, se ha informado que la PKCβII presenta peroxidación lipídica temprana, y el aumento de la peroxidación lipídica se asocia con la ferroptosis. El cribado de una biblioteca de inhibidores de quinasas mediada por CRISPR/Cas9 reveló que la PKCβII participa en el proceso de peroxidación lipídica, que es fundamental para la ferroptosis en células MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Por lo tanto, esto sugiere que la eliminación de la PKCβII mediante CRISPR/Cas9 podría ser una diana potencial para un gen supresor de tumores en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Se cree que la resistencia a los fármacos es responsable de aproximadamente el 90 % de las muertes en pacientes con cáncer y es uno de los principales desafíos en el tratamiento del cáncer (Bukowski et al., 2020). Los resultados indican que un número suficiente de genes relacionados con el eflujo de fármacos, la reparación del ADN, la apoptosis y diversas vías de señalización celular están asociados con la resistencia a los fármacos (Haider et al., 2020). Entre ellos, varios genes han sido seleccionados mediante herramientas CRISPR/Cas9 y han mostrado resultados prometedores en la reducción de la resistencia a los fármacos y el aumento de la eficacia de los tratamientos contra el cáncer (Vaghari-Tabari et al., 2022). Además, las bibliotecas de cribado de inactivación génica de alto rendimiento CRISPR/Cas9 se han utilizado para modificar la función de posibles genes diana de la resistencia a los fármacos (Shalem et al., 2015). Para identificar genes de resistencia al paclitaxel, se utilizó la secuenciación de ARN junto con el cribado de una biblioteca de sgRNA a nivel genómico para identificar ocho genes candidatos, incluida la histona deacetilasa 9 (HDAC9), que están asociados con la resistencia a fármacos en pacientes con TNBC recurrente (B et al., 2020). En otro estudio, se observó una mayor expresión de la proteína quinasa de diserina/treonina y tirosina (DSTYK) durante la supervivencia de pacientes con TNBC tratados con fármacos anticancerígenos. Además, la inhibición de DSTYK mediada por CRISPR/Cas9 mejoró significativamente la apoptosis de células cancerosas resistentes a fármacos in vitro (células SUM102PT y células MDA-MB-468) y un modelo in vivo de TNBC (Ogbu et al., 2021).
Aunque el TNBC presenta una activación anormal de la vía MAPK, el efecto clínico de las terapias dirigidas a MEK es deficiente. Un cribado de biblioteca genómica CRISPR/Cas9 reveló que la inhibición de PSMG2 (chaperona 2 del ensamblaje del proteoma) sensibiliza las células TNBC BT549 y MB468 al inhibidor de MEK AZD6244. La inactivación de PSMG2 mediante CRISPR/Cas9 alteró la función normal del proteasoma, lo que condujo al desensamblaje de PDPK1 mediado por autofagia, mejorando así aún más las células tumorales en modelos murinos de TNBC inducidos por AZD6244 (inhibidor de MEK) y MG132 (inhibidor del proteasoma). Por lo tanto, los inhibidores del proteasoma y de la MAP quinasa (MEK) pueden administrarse sinérgicamente para reducir la proliferación de células tumorales (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 también se ha utilizado para detectar la pérdida de función genética que conduce a la resistencia del TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. explicaron el mecanismo de resistencia a fármacos de las células cancerosas tratadas con JQ1, un inhibidor de bromodominio BET (BBDI), en el TNBC. Mediante CRISPR/Cas9, descubrieron que la eliminación del gen rb1 provocaba que el TNBC se volviera resistente al fármaco anticancerígeno JQ1. Por lo tanto, la función de rb1 es importante en la respuesta a los fármacos JQ1 en el TNBC. También informaron que el paclitaxel es un inhibidor de la quinasa CDK4/6/microtúbulos, y su combinación con BBDI como JQ1 puede proporcionar respuestas terapéuticas prometedoras para el TNBC resistente a fármacos (Ge et al., 2020).
Se ha informado que el perfil transcripcional del ARN largo no codificante (lncRNA) es responsable de la resistencia a la terapia neoadyuvante en el cáncer de mama triple negativo (TNBC). Este estudio muestra que cinco transcritos diferentes de lncRNA MALAT1 se expresan en altos niveles en el TNBC. Además, la eliminación de MALAT1 mediante CRISPR/Cas9 aumentó la sensibilidad de las células BT-549 de TNBC al paclitaxel y la doxorrubicina, lo que sugiere un posible papel de la resistencia a MALAT1 en el TNBC (Shaath et al., 2021).
Las mutaciones en BRCA1 (BRCA1m) son heterogéneas y, por lo tanto, difíciles de detectar. Dirigirse a PARP1 (poli(ADP-ribosa) polimerasa), el socio letal sintético de BRCA1, puede aumentar la quimiosensibilidad a fármacos en el TNBC. Usando CRISPR/Cas9, la eliminación de PARP1 aumentó la sensibilidad a fármacos anticancerígenos como doxorrubicina, gemcitabina y docetaxel a células TNBC mutantes mBRCA1, lo que sugiere que PARP1 también está involucrado en la resistencia a fármacos en TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). . . Se sabe que las mutaciones en los genes supresores de tumores BRCA1 o BRCA2 aumentan la probabilidad de desarrollar cáncer de mama en personas. El tratamiento de estos pacientes requiere el uso de inhibidores de PARP. Además, se ha demostrado que la eliminación del factor de recuperación de nucleótidos DNPH1 mediante CRISPR/Cas9 puede eliminar el nucleótido tóxico 5-hidroximetildeoxiuridina (hmdU) monofosfato, lo que mejora la respuesta de las células deficientes en BRCA a la sensibilidad a los inhibidores de PARP (Fugger et al., 2021). Por lo tanto, CRISPR/Cas9 y los inhibidores de PARP1 podrían convertirse en una importante estrategia de tratamiento para el cáncer de mama triple negativo.
El gen de la glicoproteína penetrante (P-gp) es un gen de resistencia a múltiples fármacos que generalmente se encuentra sobreexpresado en aproximadamente el 41 % de todos los casos de cáncer de mama triple negativo (TNBC) (Sun et al., 2020). El eflujo de fármacos inducido por P-gp se ha identificado como un regulador clave de la resistencia a los fármacos en el cáncer de mama. Los inhibidores de P-gp han demostrado aumentar la sensibilidad a los fármacos anticancerígenos en el cáncer de mama (Famta et al., 2021). Por lo tanto, la ablación o supresión de P-gp y sus inhibidores mediante CRISPR/Cas9 podrían ser métodos muy importantes para superar la resistencia a los fármacos en el TNBC.
Se sabe que el transportador de casete de unión a ATP G2 (ABCG2) causa resistencia a los fármacos en el TNBC (Palasuberniam et al., 2015), aunque actualmente no hay informes sobre la relación entre CRISPR/Cas9 y el silenciamiento de ABCG2 y la inactivación de genes supresores de tumores. PTEN puede potenciar la activación de ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Por lo tanto, usar CRISPR/Cas9 para eliminar ABCG2 y combinarlo con un inhibidor de ABCG2 podría ser un tratamiento adecuado para superar la resistencia a los fármacos en el TNBC. La Tabla 2 menciona que CRISPR/Cas9 se dirige a todos los genes de resistencia.
Tabla 2. CRISPR/Cas9 se dirige a varios genes de resistencia del cáncer de mama triple negativo para sensibilizar las células a los fármacos anticancerígenos.
Las bibliotecas CRISPR/Cas9 son herramientas potenciales para la detección de mutaciones genéticas asociadas a la patogénesis del cáncer (Chan et al., 2022). Este método de detección consta de cuatro pasos: (a) construcción de la biblioteca, (b) transducción lentiviral, (c) análisis fenotípico y (d) análisis del gen diana. Si bien el cáncer de mama triple negativo (TNBC) presenta una activación anómala de la vía MAPK, el pronóstico clínico de la terapia dirigida a MEK para pacientes con TNBC portadores de mutaciones en genes supresores de tumores como PTEN, RB1 y TP53 es muy desfavorable.
Además, un cribado de eliminación génica mediante CRISPR/Cas9 probó la molécula más potente y selectiva, el dehidrocatrol, que es abundante en extractos de flores y hojas guatemaltecas, para comprender el efecto del dehidrocatrol en MDA-MB-231. Mecanismos de citotoxicidad celular selectiva. Características de pluripotencia mesenquimal de los subtipos de TNBC. Este cribado basado en CRISPR/Cas9 también reveló que HSD17B11, un gen que codifica la 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 11, se expresa en gran medida en las células MDA-MB-231 y da como resultado dehidrofalcarinol específico para las células MDA-MB-231 (Grant et al., 2020). Por lo tanto, esto sugiere que el cribado genómico CRISPR/Cas9 tiene un gran potencial para identificar los mecanismos subyacentes a las propiedades anticancerígenas de posibles compuestos naturales.
Además, se estudió la vulnerabilidad del TNBC al cáncer mediante un cribado CRISPR/Cas9 in vivo a escala genómica, que mostró una relación entre las vías oncogénicas y supresoras de tumores. Se ha informado que componentes clave de las vías mTOR e Hippo desempeñan funciones importantes en la regulación tumoral en el TNBC. Adicionalmente, estudios han demostrado que la inhibición farmacológica de mTORC1/2 y la oncoproteína YAP inhibe eficazmente la patogenicidad del TNBC utilizando un modelo de sinergia fármaco-matriz in vitro y xenoinjertos derivados de pacientes in vivo. Además, la inhibición de mTORC1/2 mediada por Torin-1 aumenta la macropinocitosis, mientras que la inhibición de YAP inducida por verteporfina conduce a la muerte celular del TNBC. En conjunto, estos resultados resaltan el poder y la robustez del cribado CRISPR in vivo a escala genómica para identificar tratamientos novedosos y eficaces para el TNBC (Dai et al., 2021).
La desregulación del sistema inmunitario es un factor importante en la tumorogénesis. Las células cancerosas evaden la eliminación inmunitaria sorteando los mecanismos de defensa, lo que incluye interferir con la actividad de las células inmunitarias en el microambiente tumoral y comprometer el sistema inmunitario. Por lo tanto, desarrollar un sistema inmunitario mejorado puede ser un enfoque clave para combatir los tumores. El uso de la modificación genética basada en CRISPR/Cas9 aborda varios problemas relacionados con la disfunción inmunitaria desde diferentes perspectivas. CRISPR/Cas9 se ha utilizado para mejorar la inmunidad antitumoral contra el cáncer de mama a través de las siguientes vías (Figura 3).
Figura 3. La inmunoterapia CRISPR/Cas9 se dirige a las células TNBC. La pérdida de CDK5 y la inhibición de PDL1 y CD155 potencian el sistema inmunitario. Asimismo, la pérdida de A2AR y la inhibición de TAA como HER2, mucina 1 y TEM8 aumentaron la eficacia de las células CAR-T para eliminar las células cancerosas. El cribado de células T impulsado por CRISPR/Cas9 ha demostrado que la interrupción de la quinasa p38 potencia la actividad antitumoral de las células T. Las células T modificadas por CRISPR/Cas9 aumentan la expresión del TCR (receptor de células T), lo que resulta en que las células T tengan actividad antitumoral.
El objetivo de la inmunoterapia es estimular el sistema inmunitario para que ataque las células cancerosas. La sobreexpresión de proteínas de puntos de control inmunitarios generalmente previene las reacciones autoinmunes, pero puede ayudar a los cánceres a evitarlas (Topalian et al., 2015). Estas proteínas previenen las reacciones inmunitarias al unirse a receptores en la superficie de las células inmunitarias. Múltiples proteínas de puntos de control (como CD155 y PD-L1) se dirigen al receptor PD-1 en las células inmunitarias y se expresan en el cáncer de mama, especialmente en el TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). La inhibición de PD-L1 o su receptor mediante CRISPR/Cas9 puede estimular el sistema inmunitario para que ataque los tumores TNBC (Yahata et al., 2019). Además, se ha demostrado que la regulación negativa de la expresión de PD-L1 mediante la eliminación de CDK5 mediada por CRISPR/Cas9 inhibe el crecimiento tumoral in vitro e in vivo (Deng et al., 2020). La inhibición del crecimiento en modelos in vitro e in vivo de cáncer de mama sugiere que la reducción de CD155 mediada por shRNA puede tener un efecto terapéutico sobre el cáncer de mama (Gao et al., 2018).
Las células T CAR expresan CAR que reconocen antígenos asociados a tumores (TAA) y pueden usar la supresión de proteínas de punto de control para mejorar su actividad (Li C. et al., 2020). Existen varios objetivos potenciales para la terapia con células T CAR en el cáncer de mama, incluyendo varios TAA como HER2, mucina 1 y TEM8 (Bajgain et al., 2018). Hay evidencia de que las células T CAR dirigidas a la mesotelina (sobreexpresada en células TNBC BT-459) son más efectivas contra el cáncer cuando se inactiva PD-1 usando CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Sin embargo, aislar células T de pacientes y luego editarlas ex vivo es un proceso laborioso y que consume mucho tiempo. Aunque las células T universales pueden reducir los requisitos de aislamiento, las células T del donante que expresan el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I y el receptor de células T (TCR) deben eliminarse para prevenir anomalías de injerto contra huésped (Ren et al., 2017). , 2017a). Usando CRISPR/Cas9, HDR puede eliminar simultáneamente TCR y HLA y eliminar el gen que codifica CAR. Los estudios han demostrado que CRISPR/Cas9 puede usarse para introducir CAR anti-CD19 en el locus TCR, produciendo así CAR de manera eficiente sin agotar las células T (Dimitri et al., 2022). Se han desarrollado tecnologías multiplex para generar células T CAR alogénicas eliminando simultáneamente TCR, beta-2-microglobulina (B2M), subunidad HLA-I y otras proteínas como PD-1 y CTLA-4, que pueden tener mayores propiedades anticancerígenas contra TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
El uso de CRISPR/Cas9 podría mejorar la efectividad de las células CAR-T. Se sabe que la adenosina tiene propiedades inmunosupresoras y puede reducir la inmunidad anticancerígena al bloquear la función de las células T y activar los receptores de adenosina A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). El silenciamiento de A2AR mediante CRISPR/Cas9 mejoró significativamente la eficacia de las células CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Se sabe que las células T exhiben diversas características fenotípicas como expansión celular, diferenciación, estrés oxidativo y estrés genómico. El cribado de células T basado en CRISPR/Cas9 reveló la disrupción de 25 quinasas de receptores de células T diferentes. Entre ellas, se ha demostrado que la eliminación de la quinasa p38 mejora la actividad antitumoral de las células T, lo que indica que la quinasa p38 es un regulador clave de la regulación de las células CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Las células T pueden modificarse genéticamente mediante CRISPR/Cas9 para producir receptores de células T (TCR) de alta expresión. La transferencia de células T modificadas genéticamente a pacientes ha demostrado una actividad anticancerígena más potente que la de las células T endógenas. Por lo tanto, los TCR endógenos pueden competir con los TCR modificados genéticamente en los pacientes, lo que podría afectar el potencial de la inmunoterapia contra el cáncer. Para superar este problema, el uso de CRISPR/Cas9 para eliminar el TCR-β endógeno en las células receptoras y la posterior transferencia de células T con TCR-β a pacientes con cáncer podría generar mejores respuestas inmunitarias anticancerígenas sin la necesidad de competencia sexual del TCR endógeno (Fan et al., 2018). Así, con la excepción de las células T modificadas con CRISPR, los TCR son mil veces más sensibles a los antígenos tumorales que las células T transducidas con TCR normales. Además, en diversas leucemias, las células T modificadas generadas por CRISPR con TCR γδ presentan una mayor expresión de células T CD4+ y CD8+ que la transferencia estándar de TCR (Legut et al., 2018). Por lo tanto, las células T modificadas generadas mediante CRISPR/Cas9 podrían ser un método de inmunoterapia eficaz para combatir el cáncer de mama triple negativo.
Las integrinas son moléculas de adhesión celular presentes en las membranas celulares y promueven la unión de las células a la matriz extracelular (MEC) (Hamidi e Ivaska, 2018). La desregulación de las integrinas se asocia con el desarrollo y la migración del cáncer al alterar la matriz extracelular, lo que conduce a la supervivencia de las células cancerosas en la circulación (Hamidi e Ivaska, 2018). La inhibición de la expresión de integrinas mediante CRISPR/Cas9 ralentiza la progresión tumoral, la metástasis y la colonización en el cáncer de mama triple negativo (CMTN). Se ha informado que la inhibición de la expresión de la integrina α5 (ITGA5) reduce la migración y la progresión celular en otros tipos de cáncer, como el cáncer de pulmón (Ju et al., 2017), lo que sugiere que la integrina α5 también podría ser un factor clave en la patogénesis del CMTN.
La generación de ratones knockout mediante métodos tradicionales de células madre embrionarias (ES) es un proceso laborioso, lento e ineficiente. Se necesitan meses e incluso años para modificar las células ES mediante recombinación homóloga, criar ratones quiméricos y luego cruzarlos con ratones heterocigotos para producir descendencia homocigota. Se requiere un cruzamiento complejo para crear ratones con múltiples mutaciones genéticas. Sin embargo, han surgido muchos problemas al utilizar ratones generados por ablación de células ES con CRISPR/Cas9 o por microinyección de componentes de CRISPR/Cas9 en óvulos fertilizados de una sola célula. Por ejemplo, la introducción de cambios suele ocurrir en loci bialélicos y no es específica de genes. Recientemente se informó que las células ES que utilizan la tecnología CRISPR/Cas9 pueden insertar simultáneamente mutaciones bialélicas en hasta 5 genes (Nishizono et al., 2021). Para este propósito, se transfectaron simultáneamente ARNm de Cas9 y cinco ARN guía específicos de genes en células ES. Esto resalta la promesa y la efectividad de este procedimiento, aunque estas mutaciones podrían haberse transmitido cuando se cruzaron líneas fundadoras para producir ratones knockout quíntuples. El estudio también informa un descubrimiento sorprendente: las células ES ya no son necesarias para crear ratones genéticamente modificados. En cambio, para eliminar productos génicos específicos, se inyectaron ARNm y ARNg de Cas9 en embriones en etapa de célula única. Como resultado, se han creado líneas fundadoras knockout que teóricamente pueden usarse para estudiar las consecuencias de la deleción génica en ratones (Qin et al., 2016). Por lo tanto, CRISPR/Cas9 permite la creación de ratones transgénicos para tratar el TNBC a un costo menor que la ingeniería genética tradicional. Usando el sistema CRISPR/Cas, se ha desarrollado un nuevo modelo de ratón knockout que puede introducir con éxito mutaciones puntuales en uno o más genes endógenos en el TNBC. Basándose en este concepto, también se pueden desarrollar modelos animales de TNBC utilizando la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 de BRCA1 y p53, lo que resulta en la pérdida de la reparación HR, inestabilidad genómica y fenotipos mutantes ( Annunziato et al., 2020 ).
Actualmente, se utilizan diversos métodos, como la mamografía, la resonancia magnética (RM) y la ecografía, para diagnosticar el cáncer de mama triple negativo (CMTN). Sin embargo, estos métodos presentan algunas limitaciones. La mamografía se utiliza para diagnosticar el tejido mamario local, no las metástasis, donde las células cancerosas han migrado a otros órganos. La ecografía no es un método fiable para diagnosticar el CMTN (Chen y Lee-Felker, 2023). La RM tiene mayor sensibilidad que la ecografía y la mamografía, pero su precisión diagnóstica es limitada (Sha y Chen, 2022). La biopsia de tejido es un método invasivo para identificar células cancerosas. Sin embargo, en algunos casos, una biopsia puede pasar por alto tejido canceroso si la aguja se desvía del área de interés. Además, es muy costosa y puede resultar traumática para la paciente. El CMTN es un tipo de cáncer heterogéneo, por lo que una biopsia puede no proporcionar suficiente información sobre el tipo de cáncer. Por lo tanto, se necesita urgentemente un nuevo método diagnóstico fiable para detectar el CMTN. CRISPR/Cas9 puede servir como una alternativa altamente sensible y mínimamente invasiva para el diagnóstico del cáncer de mama. Para ello, las estrategias basadas en CRISPR/Cas9 pueden utilizarse para mejorar los métodos de PCR para el diagnóstico del cáncer de mama triple negativo (TNBC). En primer lugar, las proteínas Cas9 y cpf1 del sistema CRISPR se utilizan para eliminar el ADN no específico, y luego estas dos proteínas (Cas9 y cpf1) pueden reconocer la secuencia PAM antes de unirse al ADN diana (Deepak Singh et al., 2021). De esta forma, la PCR puede identificar mutaciones asociadas al desarrollo del cáncer. Varios estudios han adoptado esta estrategia basada en CRISPR para detectar diferentes mutaciones en distintos tipos de cáncer (Safari et al., 2019). Por lo tanto, los métodos de PCR basados ​​en CRISPR pueden reducir la dependencia del diagnóstico de TNBC de métodos invasivos como la inmunohistoquímica basada en biopsia.
También se han demostrado cambios genotípicos en la regulación de los receptores hormonales en el cáncer de mama triple negativo (TNBC) (Chen y Russo, 2009). Las estrategias de PCR basadas en CRISPR/Cas9, utilizando microarrays para diagnósticos en el punto de atención, permiten monitorizar eficazmente estas mutaciones (Hajian et al., 2019). Además, podrían proporcionar a los profesionales sanitarios información relevante sobre mutaciones específicas en pacientes con TNBC, lo que podría contribuir a mejorar su tratamiento. Sin embargo, esta técnica combinada presenta limitaciones. Por lo tanto, se requieren esfuerzos de investigación exhaustivos antes de que este método CRISPR/Cas-PCR pueda utilizarse en la atención sanitaria para el diagnóstico del TNBC (Yang et al., 2019).