El diagnóstico diferencial de los nódulos pulmonares identificados mediante tomografía computarizada (TC) sigue siendo un desafío en la práctica clínica. En este estudio, caracterizamos el metaboloma global de 480 muestras de suero, incluyendo controles sanos, nódulos pulmonares benignos y adenocarcinoma de pulmón en estadio I. Los adenocarcinomas presentan perfiles metabolómicos únicos, mientras que los nódulos benignos y los individuos sanos muestran una alta similitud en sus perfiles metabolómicos. En el grupo de descubrimiento (n = 306), se identificó un conjunto de 27 metabolitos para diferenciar entre nódulos benignos y malignos. El AUC del modelo discriminante en los grupos de validación interna (n = 104) y validación externa (n = 111) fue de 0,915 y 0,945, respectivamente. El análisis de vías metabólicas reveló un aumento de los metabolitos glucolíticos asociado a una disminución del triptófano en el suero de adenocarcinoma de pulmón en comparación con los nódulos benignos y los controles sanos, y sugirió que la captación de triptófano promueve la glucólisis en las células de cáncer de pulmón. Nuestro estudio subraya el valor de los biomarcadores de metabolitos séricos para evaluar el riesgo de nódulos pulmonares detectados mediante tomografía computarizada.
El diagnóstico precoz es fundamental para mejorar las tasas de supervivencia de los pacientes con cáncer. Los resultados del Ensayo Nacional de Detección de Cáncer de Pulmón de EE. UU. (NLST) y del Estudio Europeo NELSON han demostrado que la detección mediante tomografía computarizada de baja dosis (TCBD) puede reducir significativamente la mortalidad por cáncer de pulmón en grupos de alto riesgo1,2,3. Desde el uso generalizado de la TCBD para la detección del cáncer de pulmón, la incidencia de hallazgos radiográficos incidentales de nódulos pulmonares asintomáticos ha seguido aumentando 4. Los nódulos pulmonares se definen como opacidades focales de hasta 3 cm de diámetro 5. Nos enfrentamos a dificultades para evaluar la probabilidad de malignidad y para manejar el gran número de nódulos pulmonares detectados incidentalmente en la TCBD. Las limitaciones de la TC pueden llevar a exámenes de seguimiento frecuentes y resultados falsos positivos, lo que conlleva una intervención innecesaria y un sobretratamiento6. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar biomarcadores fiables y útiles para identificar correctamente el cáncer de pulmón en etapas tempranas y diferenciar la mayoría de los nódulos benignos en la detección inicial 7.
El análisis molecular integral de la sangre (suero, plasma, células mononucleares de sangre periférica), incluyendo genómica, proteómica o metilación del ADN8,9,10, ha generado un creciente interés en el descubrimiento de biomarcadores diagnósticos para el cáncer de pulmón. Mientras tanto, los enfoques metabolómicos miden los productos finales celulares que están influenciados por acciones endógenas y exógenas y, por lo tanto, se aplican para predecir el inicio y el resultado de la enfermedad. La cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS) es un método ampliamente utilizado para estudios metabolómicos debido a su alta sensibilidad y amplio rango dinámico, que puede cubrir metabolitos con diferentes propiedades fisicoquímicas11,12,13. Aunque el análisis metabolómico global del plasma/suero se ha utilizado para identificar biomarcadores asociados con el diagnóstico del cáncer de pulmón14,15,16,17 y la eficacia del tratamiento,18 los clasificadores de metabolitos séricos para distinguir entre nódulos pulmonares benignos y malignos aún requieren mucha investigación.
El adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas son los dos subtipos principales del cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP). Diversas pruebas de detección por TC indican que el adenocarcinoma es el tipo histológico más común de cáncer de pulmón1,19,20,21. En este estudio, utilizamos cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS) para realizar un análisis metabolómico en un total de 695 muestras de suero, incluyendo controles sanos, nódulos pulmonares benignos y TC ≤3 cm. Detección de adenocarcinoma de pulmón en estadio I. Identificamos un panel de metabolitos séricos que distinguen el adenocarcinoma de pulmón de los nódulos benignos y los controles sanos. El análisis de enriquecimiento de vías reveló que el metabolismo anormal del triptófano y la glucosa son alteraciones comunes en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con los nódulos benignos y los controles sanos. Finalmente, establecimos y validamos un clasificador metabólico sérico con alta especificidad y sensibilidad para distinguir entre nódulos pulmonares malignos y benignos detectados mediante LDCT, lo que puede ayudar en el diagnóstico diferencial precoz y la evaluación del riesgo.
En el presente estudio, se recolectaron retrospectivamente muestras de suero de 174 controles sanos, 292 pacientes con nódulos pulmonares benignos y 229 pacientes con adenocarcinoma de pulmón en estadio I, emparejados por sexo y edad. Las características demográficas de los 695 sujetos se muestran en la Tabla Suplementaria 1.
Como se muestra en la Figura 1a, se recolectaron un total de 480 muestras de suero, incluyendo 174 controles sanos (HC), 170 nódulos benignos (BN) y 136 muestras de adenocarcinoma de pulmón en estadio I (LA), en el Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen. Cohorte de descubrimiento para perfilado metabolómico no dirigido usando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS). Como se muestra en la Figura suplementaria 1, se identificaron metabolitos diferenciales entre LA y HC, LA y BN para establecer un modelo de clasificación y explorar más a fondo el análisis de vías diferenciales. 104 muestras recolectadas por el Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen y 111 muestras recolectadas por otros dos hospitales fueron sometidas a validación interna y externa, respectivamente.
a Población de estudio en la cohorte de descubrimiento que se sometió a un análisis metabolómico sérico global utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS). b Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) del metaboloma total de 480 muestras de suero de la cohorte de estudio, incluidos controles sanos (HC, n = 174), nódulos benignos (BN, n = 170) y adenocarcinoma de pulmón en estadio I (Los Ángeles, n = 136). +ESI, modo de ionización por electrospray positivo, -ESI, modo de ionización por electrospray negativo. c–e Los metabolitos con abundancias significativamente diferentes en dos grupos dados (prueba de rangos con signo de Wilcoxon de dos colas, valor p ajustado por tasa de falsos descubrimientos, FDR <0,05) se muestran en rojo (cambio de pliegue > 1,2) y azul (cambio de pliegue < 0,83). ) mostrados en el gráfico de volcán. f Mapa de calor de agrupamiento jerárquico que muestra diferencias significativas en el número de metabolitos anotados entre LA y BN. Los datos fuente se proporcionan en forma de archivos de datos fuente.
Se analizó el metaboloma sérico total de 174 HC, 170 BN y 136 LA del grupo de descubrimiento mediante análisis UPLC-HRMS. Primero mostramos que las muestras de control de calidad (CC) se agrupan estrechamente en el centro de un modelo de análisis de componentes principales (ACP) no supervisado, lo que confirma la estabilidad del rendimiento del presente estudio (Figura suplementaria 2).
Como se muestra en el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) en la Figura 1 b, encontramos que había diferencias claras entre LA y BN, LA y HC en los modos de ionización por electrospray positivo (+ESI) y negativo (−ESI). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre BN y HC en las condiciones +ESI y -ESI.
Encontramos 382 características diferenciales entre LA y HC, 231 características diferenciales entre LA y BN, y 95 características diferenciales entre BN y HC (prueba de rangos con signo de Wilcoxon, FDR <0,05 y cambio múltiple >1,2 o <0,83) (Figura .1c-e). . Los picos se anotaron además (Datos suplementarios 3) contra una base de datos (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) por valor m/z, tiempo de retención y búsqueda de espectro de masas de fragmentación (detalles descritos en la sección Métodos) 22 . Finalmente, se identificaron 33 y 38 metabolitos anotados con diferencias significativas en abundancia para LA versus BN (Figura 1f y Tabla suplementaria 2) y LA versus HC (Figura suplementaria 3 y Tabla suplementaria 2), respectivamente. En contraste, solo se identificaron 3 metabolitos con diferencias significativas en abundancia en BN y HC (Tabla suplementaria 2), consistente con la superposición entre BN y HC en PLS-DA. Estos metabolitos diferenciales cubren una amplia gama de compuestos bioquímicos (Figura suplementaria 4). En conjunto, estos resultados demuestran cambios significativos en el metaboloma sérico que reflejan la transformación maligna del cáncer de pulmón en etapa temprana en comparación con los nódulos pulmonares benignos o sujetos sanos. Mientras tanto, la similitud del metaboloma sérico de BN y HC sugiere que los nódulos pulmonares benignos pueden compartir muchas características biológicas con individuos sanos. Dado que las mutaciones del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) son comunes en el subtipo 23 de adenocarcinoma de pulmón, buscamos determinar el impacto de las mutaciones impulsoras en el metaboloma sérico. Luego analizamos el perfil metabolómico general de 72 casos con estado EGFR en el grupo de adenocarcinoma de pulmón. Curiosamente, encontramos perfiles comparables entre pacientes con mutación de EGFR (n = 41) y pacientes con EGFR de tipo salvaje (n = 31) en el análisis de componentes principales (Figura suplementaria 5a). Sin embargo, identificamos 7 metabolitos cuya abundancia se vio significativamente alterada en pacientes con mutación de EGFR en comparación con pacientes con EGFR de tipo salvaje (prueba t, p < 0,05 y cambio de pliegue > 1,2 o < 0,83) (Figura suplementaria 5b). La mayoría de estos metabolitos (5 de 7) son acilcarnitinas, que desempeñan un papel importante en las vías de oxidación de ácidos grasos.
Como se ilustra en el flujo de trabajo mostrado en la Figura 2a, los biomarcadores para la clasificación de nódulos se obtuvieron utilizando operadores de contracción absoluta mínima y selección basada en 33 metabolitos diferenciales identificados en LA (n = 136) y BN (n = 170). Mejor combinación de variables (LASSO) – modelo de regresión logística binaria. Se utilizó validación cruzada de diez pliegues para probar la fiabilidad del modelo. La selección de variables y la regularización de parámetros se ajustan mediante una penalización de maximización de verosimilitud con parámetro λ24. El análisis metabolómico global se realizó además de forma independiente en los grupos de validación interna (n = 104) y validación externa (n = 111) para probar el rendimiento de clasificación del modelo discriminante. Como resultado, 27 metabolitos en el conjunto de descubrimiento se identificaron como el mejor modelo discriminante con el mayor valor medio de AUC (Fig. 2b), entre los cuales 9 tenían actividad aumentada y 18 actividad disminuida en LA en comparación con BN (Fig. 2c).
Flujo de trabajo para construir un clasificador de nódulos pulmonares, incluyendo la selección del mejor panel de metabolitos séricos en el conjunto de descubrimiento usando un modelo de regresión logística binaria a través de validación cruzada de diez pliegues y evaluación del rendimiento predictivo en conjuntos de validación interna y externa. b Estadísticas de validación cruzada del modelo de regresión LASSO para la selección de biomarcadores metabólicos. Los números dados arriba representan el número promedio de biomarcadores seleccionados en un λ dado. La línea punteada roja representa el valor promedio de AUC en el lambda correspondiente. Las barras de error grises representan los valores mínimo y máximo de AUC. La línea punteada indica el mejor modelo con los 27 biomarcadores seleccionados. AUC, área bajo la curva característica operativa del receptor (ROC). c Cambios de pliegue de 27 metabolitos seleccionados en el grupo LA comparado con el grupo BN en el grupo de descubrimiento. Columna roja: activación. La columna azul es una disminución. d–f Curvas de características operativas del receptor (ROC) que muestran el poder del modelo discriminante basado en 27 combinaciones de metabolitos en los conjuntos de descubrimiento, validación interna y externa. Los datos de origen se proporcionan en forma de archivos de datos de origen.
Se creó un modelo de predicción basado en los coeficientes de regresión ponderados de estos 27 metabolitos (Tabla suplementaria 3). El análisis ROC basado en estos 27 metabolitos arrojó un valor de área bajo la curva (AUC) de 0,933, la sensibilidad del grupo de descubrimiento fue de 0,868 y la especificidad fue de 0,859 (Fig. 2d). Mientras tanto, entre los 38 metabolitos diferenciales anotados entre LA y HC, un conjunto de 16 metabolitos alcanzó un AUC de 0,902 con una sensibilidad de 0,801 y una especificidad de 0,856 en la discriminación de LA de HC (Figura suplementaria 6a-c). También se compararon los valores de AUC basados en diferentes umbrales de cambio de pliegue para los metabolitos diferenciales. Descubrimos que el modelo de clasificación tuvo el mejor desempeño en la discriminación entre LA y BN (HC) cuando el nivel de cambio de pliegue se estableció en 1,2 en comparación con 1,5 o 2,0 (Figura suplementaria 7a,b). El modelo de clasificación, basado en 27 grupos de metabolitos, se validó además en cohortes internas y externas. El AUC fue de 0,915 (sensibilidad 0,867, especificidad 0,811) para la validación interna y de 0,945 (sensibilidad 0,810, especificidad 0,979) para la validación externa (Fig. 2e, f). Para evaluar la eficiencia interlaboratorial, se analizaron 40 muestras de la cohorte externa en un laboratorio externo como se describe en la sección de Métodos. La precisión de la clasificación alcanzó un AUC de 0,925 (Figura suplementaria 8). Debido a que el carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) es el segundo subtipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) después del adenocarcinoma de pulmón (LUAD), también probamos la utilidad potencial validada de los perfiles metabólicos. BN y 16 casos de LUSC. El AUC de discriminación entre LUSC y BN fue de 0,776 (Figura suplementaria 9), lo que indica una capacidad menor en comparación con la discriminación entre LUAD y BN.
Estudios han demostrado que el tamaño de los nódulos en imágenes de TC está positivamente correlacionado con la probabilidad de malignidad y sigue siendo un determinante importante del tratamiento de los nódulos25,26,27. El análisis de datos de la gran cohorte del estudio de cribado NELSON mostró que el riesgo de malignidad en sujetos con nódulos <5 mm era incluso similar al de sujetos sin nódulos 28. Por lo tanto, el tamaño mínimo que requiere monitorización regular por TC es de 5 mm, como recomienda la Sociedad Torácica Británica (BTS), y de 6 mm, como recomienda la Sociedad Fleischner 29. Sin embargo, los nódulos mayores de 6 mm y sin características benignas obvias, llamados nódulos pulmonares indeterminados (NPI), siguen siendo un desafío importante en la evaluación y el manejo en la práctica clínica30,31. A continuación examinamos si el tamaño del nódulo influyó en las firmas metabolómicas utilizando muestras agrupadas de las cohortes de descubrimiento y validación interna. Centrándonos en 27 biomarcadores validados, primero comparamos los perfiles PCA de los metabolomas sub-6 mm de HC y BN. Descubrimos que la mayoría de los puntos de datos para HC y BN se superponían, lo que demuestra que los niveles de metabolitos séricos eran similares en ambos grupos (Fig. 3a). Los mapas de características en diferentes rangos de tamaño se mantuvieron conservados en BN y LA (Fig. 3b, c), mientras que se observó una separación entre nódulos malignos y benignos en el rango de 6 a 20 mm (Fig. 3d). Esta cohorte tuvo un AUC de 0,927, una especificidad de 0,868 y una sensibilidad de 0,820 para predecir la malignidad de nódulos que miden de 6 a 20 mm (Fig. 3e, f). Nuestros resultados muestran que el clasificador puede capturar cambios metabólicos causados por la transformación maligna temprana, independientemente del tamaño del nódulo.
ad Comparación de perfiles de PCA entre grupos específicos basados en un clasificador metabólico de 27 metabolitos. CC y BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. en LA 6–20 mm vs LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm y LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Curva de características operativas del receptor (ROC) que muestra el rendimiento del modelo discriminante para nódulos de 6–20 mm. f Los valores de probabilidad se calcularon en base al modelo de regresión logística para nódulos que miden 6–20 mm. La línea punteada gris representa el valor de corte óptimo (0,455). Las cifras anteriores representan el porcentaje de casos proyectados para Los Ángeles. Utilice una prueba t de Student de dos colas. PCA: análisis de componentes principales. AUC: área bajo la curva. Los datos de origen se proporcionan en forma de archivos de datos de origen.
Se seleccionaron cuatro muestras (de 44 a 61 años) con tamaños de nódulos pulmonares similares (7 a 9 mm) para ilustrar el rendimiento del modelo de predicción de malignidad propuesto (Fig. 4a, b). En la evaluación inicial, el Caso 1 se presentó como un nódulo sólido con calcificación, una característica asociada con benignidad, mientras que el Caso 2 se presentó como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sin características benignas obvias. Tres rondas de tomografías computarizadas de seguimiento mostraron que estos casos se mantuvieron estables durante un período de 4 años y, por lo tanto, se consideraron nódulos benignos (Fig. 4a). En comparación con la evaluación clínica de tomografías computarizadas seriadas, el análisis de metabolitos séricos de disparo único con el modelo clasificador actual identificó rápida y correctamente estos nódulos benignos basándose en restricciones probabilísticas (Tabla 1). La Figura 4b en el caso 3 muestra un nódulo con signos de retracción pleural, que se asocia con mayor frecuencia con malignidad32. El Caso 4 se presentó como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sin evidencia de una causa benigna. Según el modelo de clasificación, todos estos casos fueron diagnosticados como malignos (Tabla 1). El diagnóstico de adenocarcinoma pulmonar se confirmó mediante examen histopatológico tras la resección pulmonar (Fig. 4b). En el conjunto de validación externa, el clasificador metabólico predijo con precisión dos casos de nódulos pulmonares indeterminados de más de 6 mm (Figura suplementaria 10).
Imágenes de TC de la ventana axial de los pulmones de dos casos de nódulos benignos. En el caso 1, la tomografía computarizada (TC) realizada después de 4 años mostró un nódulo sólido estable de 7 mm con calcificación en el lóbulo inferior derecho. En el caso 2, la TC realizada después de 5 años reveló un nódulo estable, parcialmente sólido, con un diámetro de 7 mm en el lóbulo superior derecho. b Imágenes de TC de ventana axial de los pulmones y estudios patológicos correspondientes de dos casos de adenocarcinoma en estadio I antes de la resección pulmonar. El caso 3 reveló un nódulo con un diámetro de 8 mm en el lóbulo superior derecho con retracción pleural. El caso 4 reveló un nódulo parcialmente sólido en vidrio esmerilado de 9 mm en el lóbulo superior izquierdo. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) del tejido pulmonar resecado (barra de escala = 50 μm) que demuestra el patrón de crecimiento acinar del adenocarcinoma de pulmón. Las flechas indican los nódulos detectados en las imágenes de TC. Las imágenes teñidas con hematoxilina y eosina son imágenes representativas de múltiples (>3) campos microscópicos examinados por el patólogo.
En conjunto, nuestros resultados demuestran el valor potencial de los biomarcadores de metabolitos séricos en el diagnóstico diferencial de los nódulos pulmonares, lo que puede plantear dificultades a la hora de evaluar las pruebas de detección mediante tomografía computarizada.
Basándonos en un panel de metabolitos diferenciales validado, buscamos identificar correlatos biológicos de los principales cambios metabólicos. El análisis de enriquecimiento de vías KEGG por MetaboAnalyst identificó 6 vías comunes significativamente alteradas entre los dos grupos dados (LA vs. HC y LA vs. BN, p ajustada ≤ 0,001, efecto > 0,01). Estos cambios se caracterizaron por alteraciones en el metabolismo del piruvato, metabolismo del triptófano, metabolismo de la niacina y la nicotinamida, glucólisis, ciclo de TCA y metabolismo de las purinas (Fig. 5a). Luego realizamos metabolómica dirigida para verificar los principales cambios usando cuantificación absoluta. Determinación de metabolitos comunes en vías comúnmente alteradas por espectrometría de masas de triple cuadrupolo (QQQ) usando estándares de metabolitos auténticos. Las características demográficas de la muestra objetivo del estudio metabolómico se incluyen en la Tabla Suplementaria 4. De acuerdo con nuestros resultados metabolómicos globales, el análisis cuantitativo confirmó que la hipoxantina y la xantina, el piruvato y el lactato aumentaron en LA en comparación con BN y HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en estos metabolitos entre BN y HC.
Análisis de enriquecimiento de vías KEGG de metabolitos significativamente diferentes en el grupo LA en comparación con los grupos BN y HC. Se utilizó una prueba global de dos colas y los valores p se ajustaron utilizando el método de Holm-Bonferroni (p ajustado ≤ 0,001 y tamaño del efecto > 0,01). b–d Gráficos de violín que muestran los niveles de hipoxantina, xantina, lactato, piruvato y triptófano en suero HC, BN y LA determinados por LC-MS/MS (n = 70 por grupo). Las líneas punteadas blancas y negras indican la mediana y el cuartil, respectivamente. e Gráfico de violín que muestra la expresión normalizada de Log2TPM (transcripciones por millón) de ARNm de SLC7A5 y QPRT en adenocarcinoma de pulmón (n = 513) en comparación con tejido pulmonar normal (n = 59) en el conjunto de datos LUAD-TCGA. El cuadro blanco representa el rango intercuartil, la línea negra horizontal en el centro representa la mediana y la línea negra vertical que se extiende desde el cuadro representa el intervalo de confianza del 95% (IC). f Gráfico de correlación de Pearson de la expresión de SLC7A5 y GAPDH en adenocarcinoma de pulmón (n = 513) y tejido pulmonar normal (n = 59) en el conjunto de datos TCGA. El área gris representa el IC del 95%. r, coeficiente de correlación de Pearson. g Niveles celulares normalizados de triptófano en células A549 transfectadas con shRNA de control no específico (NC) y shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinados por LC-MS/MS. Se presenta el análisis estadístico de cinco muestras biológicamente independientes en cada grupo. h Niveles celulares de NADt (NAD total, incluyendo NAD+ y NADH) en células A549 (NC) y células A549 con silenciamiento de SLC7A5 (Sh1, Sh2). Se presenta el análisis estadístico de tres muestras biológicamente independientes en cada grupo. i La actividad glucolítica de las células A549 antes y después de la inhibición de SLC7A5 se midió mediante la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (n = 4 muestras biológicamente independientes por grupo). 2-DG,2-desoxi-D-glucosa. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas en (b–h). En (g–i), las barras de error representan la media ± DE, cada experimento se realizó tres veces de forma independiente y los resultados fueron similares. Los datos fuente se proporcionan en forma de archivos de datos fuente.
Considerando el impacto significativo del metabolismo alterado del triptófano en el grupo LA, también evaluamos los niveles séricos de triptófano en los grupos HC, BN y LA usando QQQ. Encontramos que el triptófano sérico estaba reducido en LA en comparación con HC o BN (p < 0,001, Figura 5d), lo que es consistente con hallazgos previos que los niveles circulantes de triptófano son más bajos en pacientes con cáncer de pulmón que en controles sanos del grupo de control33,34,35. Otro estudio usando el trazador PET/CT 11C-metil-L-triptófano encontró que el tiempo de retención de la señal de triptófano en el tejido de cáncer de pulmón estaba significativamente aumentado en comparación con lesiones benignas o tejido normal36. Planteamos la hipótesis de que la disminución de triptófano en el suero LA puede reflejar la captación activa de triptófano por las células de cáncer de pulmón.
También se sabe que el producto final de la vía de la quinurenina del catabolismo del triptófano es NAD+37,38, que es un sustrato importante para la reacción del gliceraldehído-3-fosfato con 1,3-bisfosfoglicerato en la glucólisis39. Si bien estudios anteriores se han centrado en el papel del catabolismo del triptófano en la regulación inmunitaria, buscamos dilucidar la interacción entre la desregulación del triptófano y las vías glucolíticas observadas en el presente estudio. Se sabe que el miembro 5 de la familia 7 de transportadores de solutos (SLC7A5) es un transportador de triptófano43,44,45. La fosforribosiltransferasa del ácido quinolínico (QPRT) es una enzima ubicada aguas abajo de la vía de la quinurenina que convierte el ácido quinolínico en NAMN46. La inspección del conjunto de datos LUAD TCGA reveló que tanto SLC7A5 como QPRT estaban significativamente regulados al alza en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal (Fig. 5e). Este incremento se observó en las etapas I y II, así como en las etapas III y IV del adenocarcinoma de pulmón (Figura complementaria 11), lo que indica alteraciones tempranas en el metabolismo del triptófano asociadas con la tumorigénesis.
Además, el conjunto de datos LUAD-TCGA mostró una correlación positiva entre la expresión de ARNm de SLC7A5 y GAPDH en muestras de pacientes con cáncer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f). Por el contrario, no se encontró una correlación significativa entre dichas firmas genéticas en tejido pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f). La reducción de SLC7A5 (Figura suplementaria 12) en células A549 redujo significativamente los niveles celulares de triptófano y NAD(H) (Figura 5g,h), lo que resultó en una actividad glucolítica atenuada medida por la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (Figura 1). 5i). Por lo tanto, basándonos en los cambios metabólicos en suero y la detección in vitro, planteamos la hipótesis de que el metabolismo del triptófano puede producir NAD+ a través de la vía de la quinurenina y desempeñar un papel importante en la promoción de la glucólisis en el cáncer de pulmón.
Los estudios han demostrado que un gran número de nódulos pulmonares indeterminados detectados por LDCT pueden llevar a la necesidad de pruebas adicionales como PET-CT, biopsia pulmonar y sobretratamiento debido a un diagnóstico falso positivo de malignidad.31 Como se muestra en la Figura 6, nuestro estudio identificó un panel de metabolitos séricos con valor diagnóstico potencial que puede mejorar la estratificación del riesgo y el manejo posterior de los nódulos pulmonares detectados por CT.
Los nódulos pulmonares se evalúan mediante tomografía computarizada de baja dosis (TCBD), cuyas características de imagen sugieren causas benignas o malignas. El pronóstico incierto de los nódulos puede dar lugar a visitas de seguimiento frecuentes, intervenciones innecesarias y sobretratamiento. La inclusión de clasificadores metabólicos séricos con valor diagnóstico puede mejorar la evaluación del riesgo y el manejo posterior de los nódulos pulmonares. Tomografía por emisión de positrones (PET).
Los datos del estudio NLST de EE. UU. y del estudio NELSON europeo sugieren que la detección precoz de grupos de alto riesgo mediante tomografía computarizada de baja dosis (TCBD) podría reducir la mortalidad por cáncer de pulmón1,3. Sin embargo, la evaluación del riesgo y el posterior manejo clínico de un gran número de nódulos pulmonares incidentales detectados mediante TCBD siguen siendo los mayores desafíos. El objetivo principal es optimizar la clasificación correcta de los protocolos existentes basados en TCBD mediante la incorporación de biomarcadores fiables.
Se han identificado ciertos biomarcadores moleculares, como los metabolitos sanguíneos, comparando el cáncer de pulmón con controles sanos15,17. En el presente estudio, nos centramos en la aplicación del análisis metabolómico sérico para distinguir entre nódulos pulmonares benignos y malignos detectados incidentalmente mediante LDCT. Comparamos el metaboloma sérico global de muestras de control sano (HC), nódulos pulmonares benignos (BN) y adenocarcinoma de pulmón en estadio I (LA) mediante análisis UPLC-HRMS. Encontramos que HC y BN tenían perfiles metabólicos similares, mientras que LA mostró cambios significativos en comparación con HC y BN. Identificamos dos conjuntos de metabolitos séricos que diferencian LA de HC y BN.
El esquema actual de identificación basado en LDCT para nódulos benignos y malignos se basa principalmente en el tamaño, la densidad, la morfología y la tasa de crecimiento de los nódulos a lo largo del tiempo30. Estudios previos han demostrado que el tamaño de los nódulos está estrechamente relacionado con la probabilidad de cáncer de pulmón. Incluso en pacientes de alto riesgo, el riesgo de malignidad en nódulos <6 mm es <1%. El riesgo de malignidad para nódulos que miden de 6 a 20 mm varía del 8% al 64%30. Por lo tanto, la Sociedad Fleischner recomienda un diámetro de corte de 6 mm para el seguimiento rutinario de TC. 29 Sin embargo, la evaluación del riesgo y el manejo de los nódulos pulmonares indeterminados (NPI) mayores de 6 mm no se han realizado adecuadamente 31. El manejo actual de la cardiopatía congénita generalmente se basa en la espera vigilante con monitoreo frecuente de TC.
Basándonos en el metaboloma validado, demostramos por primera vez la superposición de firmas metabolómicas entre individuos sanos y nódulos benignos <6 mm. La similitud biológica es consistente con hallazgos previos de TC que indican que el riesgo de malignidad para nódulos <6 mm es tan bajo como para sujetos sin nódulos.30 Cabe señalar que nuestros resultados también demuestran que los nódulos benignos <6 mm y ≥6 mm tienen una alta similitud en los perfiles metabolómicos, lo que sugiere que la definición funcional de etiología benigna es consistente independientemente del tamaño del nódulo. Por lo tanto, los paneles modernos de metabolitos séricos de diagnóstico pueden proporcionar un solo ensayo como prueba de exclusión cuando los nódulos se detectan inicialmente en la TC y potencialmente reducir el seguimiento seriado. Al mismo tiempo, el mismo panel de biomarcadores metabólicos distinguió los nódulos malignos ≥6 mm de tamaño de los nódulos benignos y proporcionó predicciones precisas para IPN de tamaño similar y características morfológicas ambiguas en las imágenes de TC. Este clasificador del metabolismo sérico tuvo un buen desempeño en la predicción de la malignidad de nódulos ≥6 mm con un AUC de 0,927. En conjunto, nuestros resultados indican que las firmas metabolómicas séricas únicas pueden reflejar específicamente los cambios metabólicos tempranos inducidos por el tumor y tienen un valor potencial como predictores de riesgo, independientemente del tamaño del nódulo.
Cabe destacar que el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y el carcinoma de células escamosas (LUSC) son los principales tipos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Dado que el LUSC está fuertemente asociado con el consumo de tabaco47 y el LUAD es la histología más común de los nódulos pulmonares incidentales detectados en la tomografía computarizada (TC) de cribado48, nuestro modelo clasificador se construyó específicamente para muestras de adenocarcinoma en estadio I. Wang y sus colegas también se centraron en el LUAD e identificaron nueve firmas lipídicas mediante lipidómica para distinguir el cáncer de pulmón en estadio temprano de los individuos sanos17. Probamos el modelo clasificador actual en 16 casos de LUSC en estadio I y 74 nódulos benignos y observamos una baja precisión de predicción de LUSC (AUC 0,776), lo que sugiere que el LUAD y el LUSC pueden tener sus propias firmas metabolómicas. De hecho, se ha demostrado que el LUAD y el LUSC difieren en etiología, origen biológico y aberraciones genéticas49. Por lo tanto, se deberían incluir otros tipos de histología en los modelos de entrenamiento para la detección poblacional del cáncer de pulmón en programas de cribado.
Aquí, identificamos las seis vías más frecuentemente alteradas en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con controles sanos y nódulos benignos. La xantina y la hipoxantina son metabolitos comunes de la vía metabólica de las purinas. De acuerdo con nuestros resultados, los intermediarios asociados con el metabolismo de las purinas aumentaron significativamente en el suero o los tejidos de pacientes con adenocarcinoma de pulmón en comparación con controles sanos o pacientes en la etapa preinvasiva15,50. Los niveles elevados de xantina e hipoxantina en suero pueden reflejar el anabolismo requerido por las células cancerosas de rápida proliferación. La desregulación del metabolismo de la glucosa es un sello distintivo bien conocido del metabolismo del cáncer51. Aquí, observamos un aumento significativo en piruvato y lactato en el grupo LA en comparación con el grupo HC y BN, lo que es consistente con informes previos de anomalías de la vía glucolítica en los perfiles del metaboloma sérico de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y controles sanos. Los resultados son consistentes52,53.
Es importante destacar que observamos una correlación inversa entre el metabolismo del piruvato y el triptófano en el suero de adenocarcinomas de pulmón. Los niveles séricos de triptófano se redujeron en el grupo LA en comparación con el grupo HC o BN. Curiosamente, un estudio previo a gran escala con una cohorte prospectiva encontró que los niveles bajos de triptófano circulante se asociaron con un mayor riesgo de cáncer de pulmón 54. El triptófano es un aminoácido esencial que obtenemos completamente de los alimentos. Concluimos que el agotamiento del triptófano sérico en el adenocarcinoma de pulmón puede reflejar un rápido agotamiento de este metabolito. Es bien sabido que el producto final del catabolismo del triptófano a través de la vía de la quinurenina es la fuente de la síntesis de novo de NAD+. Debido a que el NAD+ se produce principalmente a través de la vía de rescate, la importancia del NAD+ en el metabolismo del triptófano en la salud y la enfermedad aún está por determinar46. Nuestro análisis de la base de datos TCGA mostró que la expresión del transportador de triptófano, el transportador de solutos 7A5 (SLC7A5), aumentó significativamente en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con los controles normales y se correlacionó positivamente con la expresión de la enzima glucolítica GAPDH. Estudios previos se han centrado principalmente en el papel del catabolismo del triptófano en la supresión de la respuesta inmune antitumoral40,41,42. Aquí demostramos que la inhibición de la captación de triptófano mediante la inactivación de SLC7A5 en células de cáncer de pulmón produce una disminución posterior en los niveles celulares de NAD y una atenuación concomitante de la actividad glucolítica. En resumen, nuestro estudio proporciona una base biológica para los cambios en el metabolismo sérico asociados con la transformación maligna del adenocarcinoma de pulmón.
Las mutaciones del EGFR son las mutaciones impulsoras más comunes en pacientes con CPNM. En nuestro estudio, encontramos que los pacientes con mutación del EGFR (n = 41) tenían perfiles metabolómicos generales similares a los pacientes con EGFR de tipo salvaje (n = 31), aunque encontramos niveles séricos disminuidos de algunos pacientes con mutación del EGFR en pacientes con acilcarnitinas. La función establecida de las acilcarnitinas es transportar grupos acilo desde el citoplasma a la matriz mitocondrial, lo que conduce a la oxidación de ácidos grasos para producir energía 55. En consonancia con nuestros hallazgos, un estudio reciente también identificó perfiles metabolómicos similares entre tumores con mutación del EGFR y tumores con EGFR de tipo salvaje al analizar el metaboloma global de 102 muestras de tejido de adenocarcinoma de pulmón50. Curiosamente, también se encontró contenido de acilcarnitina en el grupo con mutación del EGFR. Por lo tanto, puede ser necesario un estudio más profundo para determinar si los cambios en los niveles de acilcarnitina reflejan cambios metabólicos inducidos por el EGFR y las vías moleculares subyacentes.
En conclusión, nuestro estudio establece un clasificador metabólico sérico para el diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares y propone un flujo de trabajo que puede optimizar la evaluación del riesgo y facilitar el manejo clínico basado en la detección mediante tomografía computarizada.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen, el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen y el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad de Zhengzhou. En los grupos de descubrimiento y validación interna, se recolectaron 174 sueros de individuos sanos y 244 sueros de nódulos benignos de individuos sometidos a exámenes médicos anuales en el Departamento de Control y Prevención del Cáncer, Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen, y 166 nódulos benignos. suero. Los adenocarcinomas de pulmón en estadio I se recolectaron del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen. En la cohorte de validación externa, hubo 48 casos de nódulos benignos, 39 casos de adenocarcinoma de pulmón en estadio I del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen y 24 casos de adenocarcinoma de pulmón en estadio I del Hospital Oncológico de Zhengzhou. El Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen también recolectó 16 casos de cáncer de pulmón de células escamosas en estadio I para probar la capacidad diagnóstica del clasificador metabólico establecido (las características del paciente se muestran en la Tabla suplementaria 5). Las muestras de la cohorte de descubrimiento y la cohorte de validación interna se recolectaron entre enero de 2018 y mayo de 2020. Las muestras para la cohorte de validación externa se recolectaron entre agosto de 2021 y octubre de 2022. Para minimizar el sesgo de género, se asignó un número aproximadamente igual de casos masculinos y femeninos a cada cohorte. Equipo de descubrimiento y equipo de revisión interna. El género del participante se determinó en base al autoinforme. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes y no se proporcionó ninguna compensación. Los sujetos con nódulos benignos fueron aquellos con una puntuación de tomografía computarizada estable a los 2 a 5 años en el momento del análisis, excepto 1 caso de la muestra de validación externa, que se recolectó preoperatoriamente y se diagnosticó por histopatología. Con la excepción de la bronquitis crónica. Los casos de adenocarcinoma de pulmón se recolectaron antes de la resección pulmonar y se confirmaron por diagnóstico patológico. Se recolectaron muestras de sangre en ayunas en tubos de separación de suero sin anticoagulantes. Las muestras de sangre se coagularon durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 2851 × g durante 10 minutos a 4 °C para obtener el sobrenadante de suero. Las alícuotas de suero se congelaron a -80 °C hasta la extracción de metabolitos. El Departamento de Prevención del Cáncer y Examen Médico del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen recolectó una mezcla de suero de 100 donantes sanos, incluyendo un número igual de hombres y mujeres de entre 40 y 55 años. Se mezclaron volúmenes iguales de cada muestra de donante, la mezcla resultante se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C. La mezcla de suero se utilizó como material de referencia para el control de calidad y la estandarización de datos.
El suero de referencia y las muestras de prueba se descongelaron y los metabolitos se extrajeron utilizando un método de extracción combinado (MTBE/metanol/agua) 56. Brevemente, 50 μl de suero se mezclaron con 225 μl de metanol helado y 750 μl de metil tert-butil éter (MTBE) helado. Agitar la mezcla e incubar en hielo durante 1 hora. Luego, las muestras se mezclaron y agitaron en vórtex con 188 μl de agua de grado MS que contenía estándares internos (13C-lactato, 13C3-piruvato, 13C-metionina y 13C6-isoleucina, adquiridos de Cambridge Isotope Laboratories). Luego, la mezcla se centrifugó a 15 000 × g durante 10 min a 4 °C, y la fase inferior se transfirió a dos tubos (125 μl cada uno) para análisis LC-MS en modos positivo y negativo. Finalmente, la muestra se evaporó hasta sequedad en un concentrador de vacío de alta velocidad.
Los metabolitos secos se reconstituyeron en 120 μl de acetonitrilo al 80%, se agitaron en vórtex durante 5 min y se centrifugaron a 15,000 × g durante 10 min a 4°C. Los sobrenadantes se transfirieron a viales de vidrio ámbar con microinsertos para estudios de metabolómica. Análisis de metabolómica no dirigida en una plataforma de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS). Los metabolitos se separaron utilizando un sistema UPLC Dionex Ultimate 3000 y una columna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). En modo de iones positivos, las fases móviles fueron 95% (A) y 50% de acetonitrilo (B), cada una con 10 mmol/L de acetato de amonio y 0,1% de ácido fórmico. En modo negativo, las fases móviles A y B contenían 95 % y 50 % de acetonitrilo, respectivamente, ambas fases contenían 10 mmol/L de acetato de amonio, pH = 9. El programa de gradiente fue el siguiente: 0–0,5 min, 2 % B; 0,5–12 min, 2–50 % B; 12–14 min, 50–98 % B; 14–16 min, 98 % B; 16–16,1 min, 98–2 % B; 16,1–20 min, 2 % B. La columna se mantuvo a 40 °C y la muestra a 10 °C en el automuestreador. El caudal fue de 0,3 ml/min, el volumen de inyección fue de 3 μl. Se utilizó un espectrómetro de masas Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) con una fuente de ionización por electrospray (ESI) en modo de barrido completo, acoplado al modo de monitorización ddMS2 para recopilar grandes volúmenes de datos. Los parámetros del espectrómetro de masas se configuraron de la siguiente manera: voltaje de pulverización +3,8 kV/-3,2 kV, temperatura del capilar 320 °C, gas de protección 40 arb, gas auxiliar 10 arb, temperatura del calentador de la sonda 350 °C, rango de barrido 70–1050 m/h, resolución 70 000. Los datos se adquirieron utilizando Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Para evaluar la calidad de los datos, se generaron muestras de control de calidad (CC) combinadas extrayendo alícuotas de 10 μL del sobrenadante de cada muestra. Se analizaron seis inyecciones de muestras de control de calidad al inicio de la secuencia analítica para evaluar la estabilidad del sistema UPLC-MS. Posteriormente, las muestras de control de calidad se introducen periódicamente en el lote. Los 11 lotes de muestras de suero de este estudio se analizaron mediante LC-MS. Se utilizaron alícuotas de una mezcla de suero de 100 donantes sanos como material de referencia en los lotes respectivos para monitorizar el proceso de extracción y ajustar los efectos entre lotes. El análisis metabolómico no dirigido de la cohorte de descubrimiento, la cohorte de validación interna y la cohorte de validación externa se realizó en el Centro de Metabolómica de la Universidad Sun Yat-sen. El laboratorio externo del Centro de Análisis y Pruebas de la Universidad Tecnológica de Guangdong también analizó 40 muestras de la cohorte externa para probar el rendimiento del modelo clasificador.
Después de la extracción y reconstitución, la cuantificación absoluta de los metabolitos séricos se midió usando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas en tándem (Agilent 6495 triple cuadrupolo) con una fuente de ionización por electrospray (ESI) en modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM). Se usó una columna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) para separar los metabolitos. La fase móvil consistió en 90 % (A) y 5 % de acetonitrilo (B) con 10 mmol/L de acetato de amonio y 0,1 % de solución de amoníaco. El programa de gradiente fue el siguiente: 0–1,5 min, 0 % B; 1,5–6,5 min, 0–15 % B; 6,5–8 min, 15 % B; 8–8,5 min, 15 %–0 % B; 8,5–11,5 min, 0 % B. La columna se mantuvo a 40 °C y la muestra a 10 °C en el automuestreador. El caudal fue de 0,3 mL/min y el volumen de inyección de 1 μL. Los parámetros de MS se configuraron de la siguiente manera: voltaje capilar ±3,5 kV, presión del nebulizador 35 psi, flujo de gas de envoltura 12 L/min, temperatura del gas de envoltura 350 °C, temperatura del gas de secado 250 °C y flujo de gas de secado 14 l/min. Las conversiones MRM de triptófano, piruvato, lactato, hipoxantina y xantina fueron 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 y 151,0–107,9 respectivamente. Los datos se recopilaron utilizando Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). En las muestras de suero, se cuantificaron el triptófano, el piruvato, el lactato, la hipoxantina y la xantina mediante curvas de calibración de soluciones de mezcla estándar. En las muestras celulares, el contenido de triptófano se normalizó con respecto al estándar interno y la masa de proteína celular.
La extracción de picos (m/z y tiempo de retención (TR)) se realizó utilizando Compound Discovery 3.1 y TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Para eliminar posibles diferencias entre lotes, cada pico característico de la muestra de prueba se dividió por el pico característico del material de referencia del mismo lote para obtener la abundancia relativa. Las desviaciones estándar relativas de los estándares internos antes y después de la estandarización se muestran en la Tabla suplementaria 6. Las diferencias entre los dos grupos se caracterizaron por la tasa de descubrimiento falso (FDR<0,05, prueba de rangos con signo de Wilcoxon) y el cambio de pliegue (>1,2 o <0,83). Los datos MS brutos de las características extraídas y los datos MS corregidos de suero de referencia se muestran en los Datos suplementarios 1 y Datos suplementarios 2, respectivamente. La anotación de picos se realizó en base a cuatro niveles definidos de identificación, incluidos metabolitos identificados, compuestos anotados putativamente, clases de compuestos caracterizadas putativamente y compuestos desconocidos 22. Basándose en búsquedas en bases de datos en Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), se seleccionaron compuestos biológicos con estándares validados que coincidían con MS/MS o anotaciones de coincidencia exacta en mzCloud (puntuación > 85) o Chemspider como intermediarios entre el metaboloma diferencial. Las anotaciones de picos para cada característica se incluyen en los Datos suplementarios 3. MetaboAnalyst 5.0 se utilizó para el análisis univariado de la abundancia de metabolitos normalizada por suma. MetaboAnalyst 5.0 también evaluó el análisis de enriquecimiento de vías KEGG basado en metabolitos significativamente diferentes. El análisis de componentes principales (PCA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) se analizaron utilizando el paquete de software ropls (v.1.26.4) con normalización de pila y autoescalado. El modelo óptimo de biomarcador de metabolitos para predecir la malignidad del nódulo se generó utilizando regresión logística binaria con operador de contracción y selección de mínimos absolutos (LASSO, paquete R v.4.1-3). El rendimiento del modelo discriminante en los conjuntos de detección y validación se caracterizó mediante la estimación del AUC basada en el análisis ROC según el paquete pROC (v.1.18.0). El umbral de probabilidad óptimo se obtuvo a partir del índice de Youden máximo del modelo (sensibilidad + especificidad – 1). Las muestras con valores menores o mayores que el umbral se clasificarán como nódulos benignos y adenocarcinoma de pulmón, respectivamente.
Las células A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) se cultivaron en medio F-12K con 10 % de FBS. Se insertaron secuencias de ARN de horquilla corta (shRNA) dirigidas a SLC7A5 y un control no dirigido (NC) en el vector lentiviral pLKO.1-puro. Las secuencias antisentido de shSLC7A5 son las siguientes: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Los anticuerpos contra SLC7A5 (#5347) y tubulina (#2148) se adquirieron de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos contra SLC7A5 y tubulina se utilizaron a una dilución de 1:1000 para el análisis de Western blot.
La prueba de estrés glucolítico Seahorse XF mide los niveles de acidificación extracelular (ECAR). En el ensayo, se administraron glucosa, oligomicina A y 2-DG de forma secuencial para evaluar la capacidad glucolítica celular, medida mediante la ECAR.
Las células A549 transfectadas con el control no dirigido (NC) y shSLC7A5 (Sh1, Sh2) se sembraron durante la noche en placas de 10 cm de diámetro. Los metabolitos celulares se extrajeron con 1 ml de metanol acuoso al 80% helado. Las células en la solución de metanol se rasparon, se recolectaron en un tubo nuevo y se centrifugaron a 15 000 × g durante 15 min a 4 °C. Se recolectaron 800 µl del sobrenadante y se secaron usando un concentrador de vacío de alta velocidad. Los precipitados de metabolitos secos se analizaron para determinar los niveles de triptófano usando LC-MS/MS como se describió anteriormente. Los niveles celulares de NAD(H) en las células A549 (NC y shSLC7A5) se midieron usando un kit colorimétrico cuantitativo de NAD+/NADH (#K337, BioVision) según las instrucciones del fabricante. Los niveles de proteína se midieron para cada muestra para normalizar la cantidad de metabolitos.
No se utilizaron métodos estadísticos para determinar preliminarmente el tamaño de la muestra. Estudios metabolómicos previos dirigidos al descubrimiento de biomarcadores15,18 se han considerado como referencias para la determinación del tamaño, y en comparación con estos informes, nuestra muestra fue adecuada. No se excluyó ninguna muestra de la cohorte de estudio. Las muestras de suero se asignaron aleatoriamente a un grupo de descubrimiento (306 casos, 74,6 %) y a un grupo de validación interna (104 casos, 25,4 %) para estudios metabolómicos no dirigidos. También seleccionamos aleatoriamente 70 casos de cada grupo del conjunto de descubrimiento para estudios metabolómicos dirigidos. Los investigadores desconocían la asignación de grupo durante la recopilación y el análisis de datos LC-MS. Los análisis estadísticos de los datos metabolómicos y los experimentos celulares se describen en las secciones respectivas de Resultados, Leyendas de figuras y Métodos. La cuantificación del triptófano celular, NADT y la actividad glucolítica se realizó tres veces de forma independiente con resultados idénticos.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Informe de Portafolio Natural asociado a este artículo.
Los datos de espectrometría de masas (EM) sin procesar de las características extraídas y los datos de EM normalizados del suero de referencia se muestran en los Datos Suplementarios 1 y 2, respectivamente. Las anotaciones de picos para las características diferenciales se presentan en los Datos Suplementarios 3. El conjunto de datos LUAD TCGA se puede descargar desde https://portal.gdc.cancer.gov/. Los datos de entrada para la elaboración del gráfico se proporcionan en los datos fuente. Los datos fuente se proporcionan para este artículo.
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Fecha de publicación: 18 de septiembre de 2023