El diagnóstico diferencial de los nódulos pulmonares identificados mediante tomografía computarizada (TC) sigue siendo un desafío en la práctica clínica.Aquí, caracterizamos el metaboloma global de 480 muestras de suero, incluidos controles sanos, nódulos pulmonares benignos y adenocarcinoma de pulmón en estadio I.Los adenocarcinomas exhiben perfiles metabólicos únicos, mientras que los nódulos benignos y los individuos sanos tienen una gran similitud en los perfiles metabólicos.En el grupo de descubrimiento (n = 306), se identificó un conjunto de 27 metabolitos para diferenciar entre nódulos benignos y malignos.El AUC del modelo discriminante en los grupos de validación interna (n = 104) y validación externa (n = 111) fue de 0,915 y 0,945, respectivamente.El análisis de la vía reveló un aumento de los metabolitos glucolíticos asociados con una disminución del triptófano en el suero del adenocarcinoma de pulmón en comparación con los nódulos benignos y los controles sanos, y sugirió que la absorción de triptófano promueve la glucólisis en las células de cáncer de pulmón.Nuestro estudio destaca el valor de los biomarcadores de metabolitos séricos para evaluar el riesgo de nódulos pulmonares detectados por TC.
El diagnóstico temprano es fundamental para mejorar las tasas de supervivencia de los pacientes con cáncer.Los resultados del ensayo nacional de detección del cáncer de pulmón (NLST) de EE. UU. y del estudio europeo NELSON han demostrado que la detección mediante tomografía computarizada de baja dosis (LDCT) puede reducir significativamente la mortalidad por cáncer de pulmón en grupos de alto riesgo1,2,3.Desde el uso generalizado de la LDCT para la detección del cáncer de pulmón, la incidencia de hallazgos radiológicos incidentales de nódulos pulmonares asintomáticos ha seguido aumentando 4 .Los nódulos pulmonares se definen como opacidades focales de hasta 3 cm de diámetro 5 .Nos enfrentamos a dificultades para evaluar la probabilidad de malignidad y tratar la gran cantidad de nódulos pulmonares detectados incidentalmente en la LDCT.Las limitaciones de la TC pueden dar lugar a exámenes de seguimiento frecuentes y resultados falsos positivos, lo que lleva a intervenciones innecesarias y tratamientos excesivos6.Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar biomarcadores fiables y útiles para identificar correctamente el cáncer de pulmón en las primeras etapas y diferenciar la mayoría de los nódulos benignos en la detección inicial 7.
El análisis molecular completo de la sangre (suero, plasma, células mononucleares de sangre periférica), incluida la genómica, la proteómica o la metilación del ADN8,9,10, ha generado un interés creciente en el descubrimiento de biomarcadores de diagnóstico del cáncer de pulmón.Mientras tanto, los enfoques metabolómicos miden los productos finales celulares que están influenciados por acciones endógenas y exógenas y, por lo tanto, se aplican para predecir la aparición y el resultado de la enfermedad.La cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS) es un método ampliamente utilizado para estudios metabolómicos debido a su alta sensibilidad y amplio rango dinámico, que puede abarcar metabolitos con diferentes propiedades fisicoquímicas11,12,13.Aunque se ha utilizado el análisis metabolómico global de plasma/suero para identificar biomarcadores asociados con el diagnóstico de cáncer de pulmón14,15,16,17 y la eficacia del tratamiento,18 los clasificadores de metabolitos séricos para distinguir entre nódulos pulmonares benignos y malignos aún deben estudiarse mucho.-investigación masiva.
El adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas son los dos subtipos principales de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).Diversas pruebas de detección por TC indican que el adenocarcinoma es el tipo histológico más común de cáncer de pulmón1,19,20,21.En este estudio, utilizamos cromatografía líquida de ultra rendimiento y espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS) para realizar análisis metabolómicos en un total de 695 muestras de suero, incluidos controles sanos, nódulos pulmonares benignos y ≤3 cm detectados por tomografía computarizada.Detección de adenocarcinoma de pulmón en estadio I.Identificamos un panel de metabolitos séricos que distinguen el adenocarcinoma de pulmón de los nódulos benignos y los controles sanos.El análisis de enriquecimiento de la vía reveló que el metabolismo anormal del triptófano y la glucosa son alteraciones comunes en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con los nódulos benignos y los controles sanos.Finalmente, establecimos y validamos un clasificador metabólico sérico con alta especificidad y sensibilidad para distinguir entre nódulos pulmonares malignos y benignos detectados por LDCT, lo que puede ayudar en el diagnóstico diferencial temprano y la evaluación de riesgos.
En el estudio actual, se recolectaron retrospectivamente muestras de suero emparejadas por sexo y edad de 174 controles sanos, 292 pacientes con nódulos pulmonares benignos y 229 pacientes con adenocarcinoma de pulmón en estadio I.Las características demográficas de los 695 sujetos se muestran en la Tabla complementaria 1.
Como se muestra en la Figura 1a, en el Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen se recogieron un total de 480 muestras de suero, incluidos 174 controles sanos (HC), 170 nódulos benignos (BN) y 136 muestras de adenocarcinoma de pulmón (LA) en estadio I.Cohorte de descubrimiento para perfiles metabolómicos no dirigidos mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento y espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS).Como se muestra en la Figura 1 complementaria, se identificaron metabolitos diferenciales entre LA y HC, LA y BN para establecer un modelo de clasificación y explorar más a fondo el análisis de vías diferenciales.104 muestras recolectadas por el Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen y 111 muestras recolectadas por otros dos hospitales fueron sometidas a validación interna y externa, respectivamente.
a Población de estudio en la cohorte de descubrimiento que se sometió a un análisis de la metabolómica sérica global mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento y espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS).b Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) del metaboloma total de 480 muestras de suero de la cohorte de estudio, incluidos controles sanos (HC, n = 174), nódulos benignos (BN, n = 170) y adenocarcinoma de pulmón en estadio I. (Los Ángeles, n = 136).+ESI, modo de ionización por electrospray positivo, -ESI, modo de ionización por electrospray negativo.c – e Los metabolitos con abundancias significativamente diferentes en dos grupos determinados (prueba de rango con signo de Wilcoxon de dos colas, valor p ajustado de tasa de descubrimiento falso, FDR <0,05) se muestran en rojo (cambio > 1,2) y azul (cambio < 0,83) .) que se muestra en el gráfico del volcán.f Mapa de calor de agrupamiento jerárquico que muestra diferencias significativas en el número de metabolitos anotados entre LA y BN.Los datos de origen se proporcionan en forma de archivos de datos de origen.
El metaboloma sérico total de 174 HC, 170 BN y 136 LA en el grupo de descubrimiento se analizó mediante análisis UPLC-HRMS.Primero mostramos que las muestras de control de calidad (QC) se agrupan estrechamente en el centro de un modelo de análisis de componentes principales (PCA) no supervisado, lo que confirma la estabilidad del desempeño del estudio actual (Figura 2 complementaria).
Como se muestra en el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) en la Figura 1 b, encontramos que había diferencias claras entre LA y BN, LA y HC en los modos de ionización por electropulverización positivo (+ESI) y negativo (-ESI). .aislado.Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas entre BN y HC en condiciones +ESI y -ESI.
Encontramos 382 características diferenciales entre LA y HC, 231 características diferenciales entre LA y BN, y 95 características diferenciales entre BN y HC (prueba de rangos con signo de Wilcoxon, FDR <0,05 y cambio múltiple >1,2 o <0,83) (Figura .1c-e )..Los picos se anotaron aún más (Datos complementarios 3) en una base de datos (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) mediante el valor m/z, el tiempo de retención y la búsqueda de espectro de masas de fragmentación (los detalles se describen en la sección de Métodos) 22.Finalmente, se identificaron 33 y 38 metabolitos anotados con diferencias significativas en abundancia para LA versus BN (Figura 1f y Tabla complementaria 2) y LA versus HC (Figura complementaria 3 y Tabla complementaria 2), respectivamente.Por el contrario, solo se identificaron 3 metabolitos con diferencias significativas en abundancia en BN y HC (Tabla complementaria 2), lo que coincide con la superposición entre BN y HC en PLS-DA.Estos metabolitos diferenciales cubren una amplia gama de productos bioquímicos (Figura 4 complementaria).En conjunto, estos resultados demuestran cambios significativos en el metaboloma sérico que reflejan la transformación maligna del cáncer de pulmón en etapa temprana en comparación con nódulos pulmonares benignos o sujetos sanos.Mientras tanto, la similitud del metaboloma sérico de BN y HC sugiere que los nódulos pulmonares benignos pueden compartir muchas características biológicas con individuos sanos.Dado que las mutaciones del gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) son comunes en el adenocarcinoma de pulmón subtipo 23, intentamos determinar el impacto de las mutaciones conductoras en el metaboloma sérico.Luego analizamos el perfil metabólico general de 72 casos con estado de EGFR en el grupo de adenocarcinoma de pulmón.Curiosamente, encontramos perfiles comparables entre pacientes con EGFR mutante (n = 41) y pacientes con EGFR de tipo salvaje (n = 31) en el análisis de PCA (Figura complementaria 5a).Sin embargo, identificamos 7 metabolitos cuya abundancia se alteró significativamente en pacientes con mutación de EGFR en comparación con pacientes con EGFR de tipo salvaje (prueba t, p <0,05 y cambio de veces> 1,2 o <0,83) (Figura complementaria 5b).La mayoría de estos metabolitos (5 de 7) son acilcarnitinas, que desempeñan un papel importante en las vías de oxidación de los ácidos grasos.
Como se ilustra en el flujo de trabajo que se muestra en la Figura 2 a, los biomarcadores para la clasificación de nódulos se obtuvieron utilizando operadores de contracción mínima absoluta y una selección basada en 33 metabolitos diferenciales identificados en LA (n = 136) y BN (n = 170).Mejor combinación de variables (LASSO) – modelo de regresión logística binaria.Se utilizó una validación cruzada diez veces para probar la confiabilidad del modelo.La selección de variables y la regularización de parámetros se ajustan mediante una penalización de maximización de probabilidad con el parámetro λ24.El análisis de la metabolómica global se realizó de forma independiente en los grupos de validación interna (n = 104) y validación externa (n = 111) para probar el rendimiento de clasificación del modelo discriminante.Como resultado, 27 metabolitos en el conjunto de descubrimiento se identificaron como el mejor modelo discriminante con el mayor valor medio de AUC (Fig. 2b), entre los cuales 9 tenían una mayor actividad y 18 una menor actividad en LA en comparación con BN (Fig. 2c).
Flujo de trabajo para crear un clasificador de nódulos pulmonares, incluida la selección del mejor panel de metabolitos séricos en el conjunto de descubrimiento mediante un modelo de regresión logística binaria mediante validación cruzada diez veces y la evaluación del rendimiento predictivo en conjuntos de validación internos y externos.b Estadísticas de validación cruzada del modelo de regresión LASSO para la selección de biomarcadores metabólicos.Los números indicados anteriormente representan el número promedio de biomarcadores seleccionados en un λ determinado.La línea de puntos roja representa el valor AUC promedio en la lambda correspondiente.Las barras de error grises representan los valores AUC mínimo y máximo.La línea de puntos indica el mejor modelo con los 27 biomarcadores seleccionados.AUC, área bajo la curva de características operativas del receptor (ROC).c Cambios veces mayores de 27 metabolitos seleccionados en el grupo LA en comparación con el grupo BN en el grupo de descubrimiento.Columna roja – activación.La columna azul es una disminución.d – f Curvas de características operativas del receptor (ROC) que muestran el poder del modelo discriminante basado en 27 combinaciones de metabolitos en los conjuntos de validación interna y externa de descubrimiento.Los datos de origen se proporcionan en forma de archivos de datos de origen.
Se creó un modelo de predicción basado en los coeficientes de regresión ponderados de estos 27 metabolitos (Tabla complementaria 3).El análisis ROC basado en estos 27 metabolitos arrojó un valor de área bajo la curva (AUC) de 0,933, la sensibilidad del grupo de descubrimiento fue de 0,868 y la especificidad fue de 0,859 (Fig. 2d).Mientras tanto, entre los 38 metabolitos diferenciales anotados entre LA y HC, un conjunto de 16 metabolitos logró un AUC de 0,902 con una sensibilidad de 0,801 y una especificidad de 0,856 para discriminar LA de HC (Figura complementaria 6a-c).También se compararon los valores de AUC basados en diferentes umbrales de cambio para metabolitos diferenciales.Descubrimos que el modelo de clasificación funcionó mejor para discriminar entre LA y BN (HC) cuando el nivel de cambio de veces se estableció en 1,2 frente a 1,5 o 2,0 (Figura complementaria 7a,b).El modelo de clasificación, basado en 27 grupos de metabolitos, se validó aún más en cohortes internas y externas.El AUC fue de 0,915 (sensibilidad 0,867, especificidad 0,811) para la validación interna y de 0,945 (sensibilidad 0,810, especificidad 0,979) para la validación externa (Fig. 2e, f).Para evaluar la eficiencia entre laboratorios, se analizaron 40 muestras de la cohorte externa en un laboratorio externo como se describe en la sección Métodos.La precisión de la clasificación alcanzó un AUC de 0,925 (Figura complementaria 8).Debido a que el carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) es el segundo subtipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) después del adenocarcinoma de pulmón (LUAD), también probamos la utilidad potencial validada de los perfiles metabólicos.BN y 16 casos de LUSC.El AUC de discriminación entre LUSC y BN fue 0,776 (Figura 9 complementaria), lo que indica una capacidad más pobre en comparación con la discriminación entre LUAD y BN.
Los estudios han demostrado que el tamaño de los nódulos en las imágenes de TC se correlaciona positivamente con la probabilidad de malignidad y sigue siendo un determinante importante del tratamiento de los nódulos25,26,27.El análisis de los datos de la gran cohorte del estudio de detección NELSON mostró que el riesgo de malignidad en sujetos con ganglios <5 mm era incluso similar al de sujetos sin ganglios 28 .Por tanto, el tamaño mínimo que requiere monitorización periódica por TC es de 5 mm, según lo recomendado por la British Thoracic Society (BTS), y de 6 mm, según lo recomendado por la Fleischner Society 29 .Sin embargo, los nódulos mayores de 6 mm y sin características benignas obvias, llamados nódulos pulmonares indeterminados (NPI), siguen siendo un desafío importante en la evaluación y el tratamiento en la práctica clínica30,31.A continuación, examinamos si el tamaño del nódulo influía en las firmas metabolómicas utilizando muestras agrupadas de las cohortes de descubrimiento y validación interna.Centrándonos en 27 biomarcadores validados, primero comparamos los perfiles de PCA de los metabolomas de HC y BN de menos de 6 mm.Descubrimos que la mayoría de los puntos de datos para HC y BN se superponían, lo que demuestra que los niveles de metabolitos séricos eran similares en ambos grupos (Fig. 3a).Los mapas de características en diferentes rangos de tamaño permanecieron conservados en BN y LA (Fig. 3b, c), mientras que se observó una separación entre nódulos malignos y benignos en el rango de 6 a 20 mm (Fig. 3d).Esta cohorte tuvo un AUC de 0,927, una especificidad de 0,868 y una sensibilidad de 0,820 para predecir la malignidad de nódulos que miden de 6 a 20 mm (Fig. 3e, f).Nuestros resultados muestran que el clasificador puede capturar los cambios metabólicos causados por la transformación maligna temprana, independientemente del tamaño del nódulo.
ad Comparación de perfiles de PCA entre grupos específicos basada en un clasificador metabólico de 27 metabolitos.CC y BN < 6 mm.b BN < 6 mm frente a BN 6–20 mm.en LA 6-20 mm versus LA 20-30 mm.g BN 6–20 mm y LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6-20 mm, n = 91;LA 6-20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Curva característica operativa del receptor (ROC) que muestra el rendimiento del modelo discriminante para nódulos de 6–20 mm.f Los valores de probabilidad se calcularon con base en el modelo de regresión logística para nódulos que miden entre 6 y 20 mm.La línea de puntos gris representa el valor de corte óptimo (0,455).Los números anteriores representan el porcentaje de casos proyectados para Los Ángeles.Utilice una prueba t de Student de dos colas.PCA, análisis de componentes principales.Área AUC bajo la curva.Los datos de origen se proporcionan en forma de archivos de datos de origen.
Se seleccionaron además cuatro muestras (de 44 a 61 años) con tamaños de nódulos pulmonares similares (7 a 9 mm) para ilustrar el rendimiento del modelo de predicción de malignidad propuesto (Fig. 4a, b).En la evaluación inicial, el Caso 1 se presentó como un nódulo sólido con calcificación, una característica asociada con benignidad, mientras que el Caso 2 se presentó como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sin características benignas obvias.Tres rondas de tomografías computarizadas de seguimiento mostraron que estos casos permanecieron estables durante un período de 4 años y, por lo tanto, se consideraron nódulos benignos (Fig. 4a).En comparación con la evaluación clínica de tomografías computarizadas en serie, el análisis de metabolitos séricos de un solo disparo con el modelo clasificador actual identificó rápida y correctamente estos nódulos benignos basándose en restricciones probabilísticas (Tabla 1).La figura 4b del caso 3 muestra un nódulo con signos de retracción pleural, que con mayor frecuencia se asocia a malignidad32.El caso 4 se presentó como un nódulo parcialmente sólido indeterminado sin evidencia de causa benigna.Todos estos casos fueron predichos como malignos según el modelo clasificador (Tabla 1).La evaluación del adenocarcinoma de pulmón se demostró mediante examen histopatológico después de la cirugía de resección pulmonar (Fig. 4b).Para el conjunto de validación externa, el clasificador metabólico predijo con precisión dos casos de nódulos pulmonares indeterminados de más de 6 mm (Figura 10 complementaria).
Imágenes de TC de la ventana axial de los pulmones de dos casos de nódulos benignos.En el caso 1, la tomografía computarizada a los 4 años mostró un nódulo sólido estable de 7 mm con calcificación en el lóbulo inferior derecho.En el caso 2, la tomografía computarizada después de 5 años reveló un nódulo estable, parcialmente sólido, con un diámetro de 7 mm en el lóbulo superior derecho.b Imágenes de TC en ventana axial de los pulmones y estudios patológicos correspondientes de dos casos de adenocarcinoma en estadio I antes de la resección pulmonar.El caso 3 reveló un nódulo de 8 mm de diámetro en el lóbulo superior derecho con retracción pleural.El caso 4 reveló un nódulo en vidrio esmerilado parcialmente sólido de 9 mm en el lóbulo superior izquierdo.Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de tejido pulmonar resecado (barra de escala = 50 μm) que demuestra el patrón de crecimiento acinar del adenocarcinoma de pulmón.Las flechas indican nódulos detectados en imágenes de TC.Las imágenes H&E son imágenes representativas de múltiples (>3) campos microscópicos examinados por el patólogo.
En conjunto, nuestros resultados demuestran el valor potencial de los biomarcadores de metabolitos séricos en el diagnóstico diferencial de los nódulos pulmonares, lo que puede plantear desafíos al evaluar la detección por TC.
Basándonos en un panel de metabolitos diferenciales validado, buscamos identificar correlatos biológicos de cambios metabólicos importantes.El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG realizado por MetaboAnalyst identificó 6 vías comunes significativamente alteradas entre los dos grupos dados (LA versus HC y LA versus BN, p ajustado ≤ 0,001, efecto > 0,01).Estos cambios se caracterizaron por alteraciones en el metabolismo del piruvato, el metabolismo del triptófano, el metabolismo de la niacina y la nicotinamida, la glucólisis, el ciclo del TCA y el metabolismo de las purinas (Fig. 5a).Luego realizamos metabolómica dirigida para verificar cambios importantes mediante cuantificación absoluta.Determinación de metabolitos comunes en vías comúnmente alteradas mediante espectrometría de masas de triple cuadrupolo (QQQ) utilizando estándares de metabolitos auténticos.Las características demográficas de la muestra objetivo del estudio de metabolómica se incluyen en la Tabla complementaria 4. De acuerdo con nuestros resultados de metabolómica global, el análisis cuantitativo confirmó que la hipoxantina y la xantina, el piruvato y el lactato aumentaron en LA en comparación con BN y HC (Fig. 5b, c, p<0,05).Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en estos metabolitos entre BN y HC.
Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de metabolitos significativamente diferentes en el grupo LA en comparación con los grupos BN y HC.Se utilizó un Globaltest de dos colas y los valores de p se ajustaron mediante el método de Holm-Bonferroni (p ajustado ≤ 0,001 y tamaño del efecto > 0,01).b – d Gráficos de violín que muestran los niveles de hipoxantina, xantina, lactato, piruvato y triptófano en HC, BN y LA séricos determinados por LC-MS/MS (n = 70 por grupo).Las líneas de puntos blancas y negras indican la mediana y el cuartil, respectivamente.e Gráfico de violín que muestra la expresión de ARNm Log2TPM (transcripciones por millón) normalizada de SLC7A5 y QPRT en adenocarcinoma de pulmón (n = 513) en comparación con tejido pulmonar normal (n = 59) en el conjunto de datos LUAD-TCGA.El cuadro blanco representa el rango intercuartil, la línea negra horizontal en el centro representa la mediana y la línea negra vertical que se extiende desde el cuadro representa el intervalo de confianza (IC) del 95%.f Gráfico de correlación de Pearson de la expresión de SLC7A5 y GAPDH en adenocarcinoma de pulmón (n = 513) y tejido pulmonar normal (n = 59) en el conjunto de datos TCGA.El área gris representa el IC del 95%.r, coeficiente de correlación de Pearson.g Niveles de triptófano celular normalizados en células A549 transfectadas con control de shRNA (NC) no específico y shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinados por LC-MS/MS.Se presenta el análisis estadístico de cinco muestras biológicamente independientes en cada grupo.h Niveles celulares de NADt (NAD total, incluidos NAD+ y NADH) en células A549 (NC) y células A549 con eliminación SLC7A5 (Sh1, Sh2).Se presenta el análisis estadístico de tres muestras biológicamente independientes en cada grupo.i La actividad glicolítica de las células A549 antes y después de la eliminación de SLC7A5 se midió mediante la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (n = 4 muestras biológicamente independientes por grupo).2-DG,2-desoxi-D-glucosa.Se utilizó la prueba t de Student de dos colas en (b – h).En (g – i), las barras de error representan la media ± DE, cada experimento se realizó tres veces de forma independiente y los resultados fueron similares.Los datos de origen se proporcionan en forma de archivos de datos de origen.
Teniendo en cuenta el impacto significativo de la alteración del metabolismo del triptófano en el grupo LA, también evaluamos los niveles séricos de triptófano en los grupos HC, BN y LA utilizando QQQ.Encontramos que el triptófano sérico se redujo en LA en comparación con HC o BN (p <0,001, Figura 5d), lo que es consistente con hallazgos previos de que los niveles circulantes de triptófano son más bajos en pacientes con cáncer de pulmón que en controles sanos del grupo de control33,34 ,35.Otro estudio que utilizó el marcador PET/CT 11C-metil-L-triptófano encontró que el tiempo de retención de la señal de triptófano en el tejido del cáncer de pulmón aumentó significativamente en comparación con las lesiones benignas o el tejido normal36.Presumimos que la disminución de triptófano en el suero de LA puede reflejar la absorción activa de triptófano por parte de las células de cáncer de pulmón.
También se sabe que el producto final de la vía de la quinurenina del catabolismo del triptófano es NAD+37,38, que es un sustrato importante para la reacción del gliceraldehído-3-fosfato con 1,3-bisfosfoglicerato en la glucólisis39.Si bien estudios anteriores se han centrado en el papel del catabolismo del triptófano en la regulación inmune, intentamos dilucidar la interacción entre la desregulación del triptófano y las vías glucolíticas observadas en el estudio actual.Se sabe que el miembro 5 de la familia de transportadores de solutos 7 (SLC7A5) es un transportador de triptófano43,44,45.La fosforribosiltransferasa del ácido quinolínico (QPRT) es una enzima ubicada aguas abajo de la vía de la quinurenina que convierte el ácido quinolínico en NAMN46.La inspección del conjunto de datos LUAD TCGA reveló que tanto SLC7A5 como QPRT estaban significativamente regulados positivamente en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal (Fig. 5e).Este aumento se observó en los estadios I y II, así como en los estadios III y IV del adenocarcinoma de pulmón (Figura 11 complementaria), lo que indica alteraciones tempranas en el metabolismo del triptófano asociadas con la tumorigénesis.
Además, el conjunto de datos LUAD-TCGA mostró una correlación positiva entre la expresión de ARNm de SLC7A5 y GAPDH en muestras de pacientes con cáncer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f).Por el contrario, no se encontró una correlación significativa entre dichas firmas genéticas en el tejido pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f).La eliminación de SLC7A5 (Figura 12 complementaria) en células A549 redujo significativamente los niveles de triptófano celular y NAD (H) (Figura 5g, h), lo que resultó en una actividad glucolítica atenuada medida por la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (Figura 1).5i).Por lo tanto, basándose en los cambios metabólicos en el suero y la detección in vitro, planteamos la hipótesis de que el metabolismo del triptófano puede producir NAD+ a través de la vía de la quinurenina y desempeñar un papel importante en la promoción de la glucólisis en el cáncer de pulmón.
Los estudios han demostrado que una gran cantidad de nódulos pulmonares indeterminados detectados mediante LDCT pueden llevar a la necesidad de pruebas adicionales como PET-CT, biopsia pulmonar y sobretratamiento debido a un diagnóstico falso positivo de malignidad.31 Como se muestra en la Figura 6, Nuestro estudio identificó un panel de metabolitos séricos con valor diagnóstico potencial que puede mejorar la estratificación del riesgo y el manejo posterior de los nódulos pulmonares detectados por TC.
Los nódulos pulmonares se evalúan mediante tomografía computarizada de dosis baja (LDCT) con características de imagen que sugieren causas benignas o malignas.El resultado incierto de los nódulos puede dar lugar a visitas de seguimiento frecuentes, intervenciones innecesarias y tratamiento excesivo.La inclusión de clasificadores metabólicos séricos con valor diagnóstico puede mejorar la evaluación del riesgo y el tratamiento posterior de los nódulos pulmonares.Tomografía por emisión de positrones PET.
Los datos del estudio NLST de EE. UU. y del estudio europeo NELSON sugieren que la detección de grupos de alto riesgo con tomografía computarizada de baja dosis (LDCT) puede reducir la mortalidad por cáncer de pulmón1,3.Sin embargo, la evaluación de riesgos y el tratamiento clínico posterior de un gran número de nódulos pulmonares incidentales detectados mediante LDCT siguen siendo los más desafiantes.El objetivo principal es optimizar la clasificación correcta de los protocolos existentes basados en LDCT mediante la incorporación de biomarcadores fiables.
Ciertos biomarcadores moleculares, como los metabolitos sanguíneos, se han identificado comparando el cáncer de pulmón con controles sanos15,17.En el estudio actual, nos centramos en la aplicación del análisis de la metabolómica sérica para distinguir entre nódulos pulmonares benignos y malignos detectados incidentalmente mediante LDCT.Comparamos el metaboloma sérico global de muestras de control sano (HC), nódulos pulmonares benignos (BN) y adenocarcinoma de pulmón (LA) en estadio I mediante análisis UPLC-HRMS.Encontramos que HC y BN tenían perfiles metabólicos similares, mientras que LA mostró cambios significativos en comparación con HC y BN.Identificamos dos conjuntos de metabolitos séricos que diferencian LA de HC y BN.
El actual esquema de identificación de nódulos benignos y malignos basado en LDCT se basa principalmente en el tamaño, la densidad, la morfología y la tasa de crecimiento de los nódulos a lo largo del tiempo30.Estudios anteriores han demostrado que el tamaño de los nódulos está estrechamente relacionado con la probabilidad de cáncer de pulmón.Incluso en pacientes de alto riesgo, el riesgo de malignidad en ganglios <6 mm es <1%.El riesgo de malignidad para nódulos que miden entre 6 y 20 mm oscila entre el 8% y el 64%30.Por lo tanto, la Fleischner Society recomienda un diámetro de corte de 6 mm para el seguimiento rutinario por TC.29 Sin embargo, la evaluación de riesgos y el tratamiento de los nódulos pulmonares indeterminados (NPI) mayores de 6 mm no se han realizado adecuadamente 31 .El tratamiento actual de la cardiopatía congénita suele basarse en una conducta expectante con monitorización frecuente por TC.
Basándonos en el metaboloma validado, demostramos por primera vez la superposición de firmas metabolómicas entre individuos sanos y nódulos benignos <6 mm.La similitud biológica es consistente con hallazgos de TC previos de que el riesgo de malignidad para nódulos <6 mm es tan bajo como para sujetos sin ganglios.30 Cabe señalar que nuestros resultados también demuestran que los nódulos benignos <6 mm y ≥6 mm tienen alta similitud en los perfiles metabolómicos, lo que sugiere que la definición funcional de etiología benigna es consistente independientemente del tamaño del nódulo.Por lo tanto, los paneles de diagnóstico de metabolitos séricos modernos pueden proporcionar un único ensayo como prueba de exclusión cuando se detectan inicialmente nódulos en la TC y potencialmente reducir la monitorización en serie.Al mismo tiempo, el mismo panel de biomarcadores metabólicos distinguió nódulos malignos ≥6 mm de tamaño de nódulos benignos y proporcionó predicciones precisas para NPI de tamaño similar y características morfológicas ambiguas en imágenes de TC.Este clasificador del metabolismo sérico tuvo un buen rendimiento en la predicción de la malignidad de nódulos ≥6 mm con un AUC de 0,927.En conjunto, nuestros resultados indican que las firmas metabolómicas séricas únicas pueden reflejar específicamente cambios metabólicos tempranos inducidos por tumores y tener un valor potencial como predictores de riesgo, independientemente del tamaño del nódulo.
En particular, el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y el carcinoma de células escamosas (LUSC) son los principales tipos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).Dado que LUSC está fuertemente asociado con el consumo de tabaco47 y LUAD es la histología más común de nódulos pulmonares incidentales detectados en la detección por TC48, nuestro modelo clasificador se construyó específicamente para muestras de adenocarcinoma en estadio I.Wang y sus colegas también se centraron en LUAD e identificaron nueve firmas de lípidos utilizando lipidómica para distinguir el cáncer de pulmón en etapa temprana de los individuos sanos17.Probamos el modelo clasificador actual en 16 casos de LUSC en estadio I y 74 nódulos benignos y observamos una precisión de predicción de LUSC baja (AUC 0,776), lo que sugiere que LUAD y LUSC pueden tener sus propias firmas metabolómicas.De hecho, se ha demostrado que LUAD y LUSC difieren en etiología, origen biológico y aberraciones genéticas49.Por lo tanto, se deben incluir otros tipos de histología en los modelos de entrenamiento para la detección poblacional del cáncer de pulmón en los programas de detección.
Aquí, identificamos las seis vías alteradas con mayor frecuencia en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con controles sanos y nódulos benignos.La xantina y la hipoxantina son metabolitos comunes de la vía metabólica de las purinas.De acuerdo con nuestros resultados, los intermediarios asociados con el metabolismo de las purinas aumentaron significativamente en el suero o los tejidos de pacientes con adenocarcinoma de pulmón en comparación con controles sanos o pacientes en la etapa preinvasiva15,50.Los niveles elevados de xantina e hipoxantina séricas pueden reflejar el anabolismo requerido por las células cancerosas que proliferan rápidamente.La desregulación del metabolismo de la glucosa es una característica bien conocida del metabolismo del cáncer51.Aquí, observamos un aumento significativo de piruvato y lactato en el grupo LA en comparación con el grupo HC y BN, lo que es consistente con informes previos de anomalías de la vía glucolítica en los perfiles del metaboloma sérico de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y controles saludables.los resultados son consistentes52,53.
Es importante destacar que observamos una correlación inversa entre el metabolismo del piruvato y del triptófano en el suero de los adenocarcinomas de pulmón.Los niveles séricos de triptófano se redujeron en el grupo LA en comparación con el grupo HC o BN.Curiosamente, un estudio previo a gran escala que utilizó una cohorte prospectiva encontró que los niveles bajos de triptófano circulante se asociaban con un mayor riesgo de cáncer de pulmón 54 .El triptófano es un aminoácido esencial que obtenemos enteramente de los alimentos.Concluimos que el agotamiento del triptófano sérico en el adenocarcinoma de pulmón puede reflejar un rápido agotamiento de este metabolito.Es bien sabido que el producto final del catabolismo del triptófano a través de la vía de la quinurenina es la fuente de la síntesis de novo de NAD+.Debido a que el NAD+ se produce principalmente a través de la vía de rescate, aún no se ha determinado la importancia del NAD+ en el metabolismo del triptófano en la salud y la enfermedad46.Nuestro análisis de la base de datos TCGA mostró que la expresión del transportador de soluto 7A5 (SLC7A5) del transportador de triptófano aumentó significativamente en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con los controles normales y se correlacionó positivamente con la expresión de la enzima glicolítica GAPDH.Estudios anteriores se han centrado principalmente en el papel del catabolismo del triptófano en la supresión de la respuesta inmune antitumoral40,41,42.Aquí demostramos que la inhibición de la absorción de triptófano mediante la eliminación de SLC7A5 en células de cáncer de pulmón da como resultado una disminución posterior en los niveles celulares de NAD y una atenuación concomitante de la actividad glucolítica.En resumen, nuestro estudio proporciona una base biológica para los cambios en el metabolismo sérico asociados con la transformación maligna del adenocarcinoma de pulmón.
Las mutaciones de EGFR son las mutaciones conductoras más comunes en pacientes con NSCLC.En nuestro estudio, encontramos que los pacientes con mutación de EGFR (n = 41) tenían perfiles metabólicos generales similares a los pacientes con EGFR de tipo salvaje (n = 31), aunque encontramos niveles séricos reducidos de algunos pacientes con mutación de EGFR en pacientes con acilcarnitina.La función establecida de las acilcarnitinas es transportar grupos acilo desde el citoplasma a la matriz mitocondrial, lo que lleva a la oxidación de los ácidos grasos para producir energía 55 .De acuerdo con nuestros hallazgos, un estudio reciente también identificó perfiles de metaboloma similares entre tumores EGFR mutantes y EGFR de tipo salvaje mediante el análisis del metaboloma global de 102 muestras de tejido de adenocarcinoma de pulmón50.Curiosamente, también se encontró contenido de acilcarnitina en el grupo mutante EGFR.Por lo tanto, puede merecer más estudio si los cambios en los niveles de acilcarnitina reflejan cambios metabólicos inducidos por EGFR y las vías moleculares subyacentes.
En conclusión, nuestro estudio establece un clasificador metabólico sérico para el diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares y propone un flujo de trabajo que puede optimizar la evaluación de riesgos y facilitar el manejo clínico basado en la detección por tomografía computarizada.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen, el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen y el Comité de Ética del Hospital Oncológico de la Universidad de Zhengzhou.En los grupos de descubrimiento y validación interna, se recolectaron 174 sueros de individuos sanos y 244 sueros de nódulos benignos de personas sometidas a exámenes médicos anuales en el Departamento de Control y Prevención del Cáncer del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen, y 166 nódulos benignos.suero.Los adenocarcinomas de pulmón en estadio I se obtuvieron del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen.En la cohorte de validación externa, hubo 48 casos de nódulos benignos, 39 casos de adenocarcinoma de pulmón en estadio I del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-sen y 24 casos de adenocarcinoma de pulmón en estadio I del Hospital Oncológico de Zhengzhou.El Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen también recopiló 16 casos de cáncer de pulmón de células escamosas en estadio I para probar la capacidad de diagnóstico del clasificador metabólico establecido (las características de los pacientes se muestran en la Tabla complementaria 5).Se recolectaron muestras de la cohorte de descubrimiento y de la cohorte de validación interna entre enero de 2018 y mayo de 2020. Las muestras para la cohorte de validación externa se recolectaron entre agosto de 2021 y octubre de 2022. Para minimizar el sesgo de género, se asignó a cada uno un número aproximadamente igual de casos masculinos y femeninos. grupo.Equipo de descubrimiento y equipo de revisión interna.El género de los participantes se determinó basándose en el autoinforme.Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes y no se proporcionó ninguna compensación.Los sujetos con nódulos benignos fueron aquellos con una puntuación de tomografía computarizada estable entre 2 y 5 años en el momento del análisis, excepto 1 caso de la muestra de validación externa, que se recogió preoperatoriamente y se diagnosticó mediante histopatología.A excepción de la bronquitis crónica.Los casos de adenocarcinoma de pulmón se recogieron antes de la resección pulmonar y se confirmaron mediante diagnóstico patológico.Se recogieron muestras de sangre en ayunas en tubos de separación de suero sin ningún anticoagulante.Las muestras de sangre se coagularon durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 2851 × g durante 10 minutos a 4 ° C para recolectar el sobrenadante de suero.Se congelaron alícuotas de suero a -80°C hasta la extracción del metabolito.El Departamento de Prevención del Cáncer y Exámenes Médicos del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen recolectó un conjunto de suero de 100 donantes sanos, incluido un número igual de hombres y mujeres de entre 40 y 55 años.Se mezclaron volúmenes iguales de cada muestra de donante, se dividieron en alícuotas el conjunto resultante y se almacenó a -80°C.La mezcla de suero se utilizó como material de referencia para el control de calidad y la estandarización de datos.
El suero de referencia y las muestras de prueba se descongelaron y los metabolitos se extrajeron utilizando un método de extracción combinado (MTBE/metanol/agua) 56.Brevemente, se mezclaron 50 µl de suero con 225 µl de metanol helado y 750 µl de metil terc-butil éter (MTBE) helado.Revuelva la mezcla e incube en hielo durante 1 hora.Luego, las muestras se mezclaron y se mezclaron en vórtice con 188 μl de agua de grado MS que contenía estándares internos (lactato de 13C, piruvato de 13C3, metionina de 13C y isoleucina de 13C6, adquiridos en Cambridge Isotope Laboratories).Luego, la mezcla se centrifugó a 15.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C y la fase inferior se transfirió a dos tubos (125 μl cada uno) para el análisis LC-MS en modos positivo y negativo.Finalmente, la muestra se evaporó hasta sequedad en un concentrador de vacío de alta velocidad.
Los metabolitos secos se reconstituyeron en 120 µl de acetonitrilo al 80 %, se agitaron durante 5 minutos y se centrifugaron a 15.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.Los sobrenadantes se transfirieron a viales de vidrio de color ámbar con microinsertos para estudios de metabolómica.Análisis de metabolómica no dirigida en una plataforma de cromatografía líquida de ultra rendimiento y espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS).Los metabolitos se separaron utilizando un sistema UPLC Dionex Ultimate 3000 y una columna de amida ACQUITY BEH (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters).En el modo de iones positivos, las fases móviles eran 95 % (A) y 50 % de acetonitrilo (B), cada una de las cuales contenía 10 mmol/l de acetato de amonio y 0,1 % de ácido fórmico.En modo negativo, las fases móviles A y B contenían 95 % y 50 % de acetonitrilo, respectivamente, ambas fases contenían 10 mmol/L de acetato de amonio, pH = 9. El programa de gradiente fue el siguiente: 0–0,5 min, 2 % B;0,5 a 12 min, 2 a 50 % B;12 a 14 min, 50 a 98 % B;14 a 16 min, 98 % B;16–16.1.mín., 98 –2% B;16,1–20 min, 2 % B. La columna se mantuvo a 40 °C y la muestra a 10 °C en el muestreador automático.El caudal fue de 0,3 ml/min y el volumen de inyección fue de 3 µl.Se operó un espectrómetro de masas Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) en modo de escaneo completo y se combinó con el modo de monitoreo ddMS2 para recopilar grandes volúmenes de datos.Los parámetros de MS se configuraron de la siguiente manera: voltaje de pulverización +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura del capilar 320 °C, gas de protección 40 arb, gas auxiliar 10 arb, temperatura del calentador de la sonda 350 °C, rango de escaneo 70–1050 m/h, resolución.70 000. Los datos se adquirieron utilizando Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Para evaluar la calidad de los datos, se generaron muestras agrupadas de control de calidad (QC) eliminando alícuotas de 10 μl del sobrenadante de cada muestra.Se analizaron seis inyecciones de muestras de control de calidad al comienzo de la secuencia analítica para evaluar la estabilidad del sistema UPLC-MS.Luego, periódicamente se introducen muestras de control de calidad en el lote.Los 11 lotes de muestras de suero de este estudio se analizaron mediante LC-MS.Se utilizaron alícuotas de una mezcla de suero de 100 donantes sanos como material de referencia en los lotes respectivos para monitorear el proceso de extracción y ajustar los efectos de un lote a otro.El análisis metabolómico no dirigido de la cohorte de descubrimiento, la cohorte de validación interna y la cohorte de validación externa se realizó en el Centro de Metabolómica de la Universidad Sun Yat-sen.El laboratorio externo del Centro de Pruebas y Análisis de Tecnología de la Universidad de Guangdong también analizó 40 muestras de la cohorte externa para probar el rendimiento del modelo clasificador.
Después de la extracción y reconstitución, la cuantificación absoluta de los metabolitos séricos se midió mediante cromatografía líquida de rendimiento ultra alto-espectrometría de masas en tándem (triple cuadrupolo Agilent 6495) con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) en modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM).Se utilizó una columna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) para separar los metabolitos.La fase móvil constaba de 90 % (A) y 5 % de acetonitrilo (B) con 10 mmol/l de acetato de amonio y solución de amoníaco al 0,1 %.El programa de gradiente fue el siguiente: 0–1,5 min, 0% B;1,5 a 6,5 min, 0 a 15 % B;6,5 a 8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0 % B.La columna se mantuvo a 40 °C y la muestra a 10 °C en el muestreador automático.El caudal fue de 0,3 ml/min y el volumen de inyección fue de 1 μl.Los parámetros de MS se establecieron de la siguiente manera: voltaje capilar ±3,5 kV, presión del nebulizador 35 psi, flujo de gas de envoltura 12 L/min, temperatura del gas de envoltura 350 °C, temperatura del gas de secado 250 °C y flujo de gas de secado 14 l/min.Las conversiones MRM de triptófano, piruvato, lactato, hipoxantina y xantina fueron 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 y 151,0–107.9 respectivamente.Los datos se recopilaron utilizando Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Para las muestras de suero, se cuantificaron triptófano, piruvato, lactato, hipoxantina y xantina utilizando curvas de calibración de soluciones de mezcla estándar.Para las muestras de células, el contenido de triptófano se normalizó con respecto al estándar interno y la masa de proteína celular.
La extracción máxima (m/z y tiempo de retención (RT)) se realizó utilizando Compound Discovery 3.1 y TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Para eliminar posibles diferencias entre lotes, cada pico característico de la muestra de prueba se dividió por el pico característico del material de referencia del mismo lote para obtener la abundancia relativa.Las desviaciones estándar relativas de los estándares internos antes y después de la estandarización se muestran en la Tabla complementaria 6. Las diferencias entre los dos grupos se caracterizaron por una tasa de descubrimiento falso (FDR <0,05, prueba de rango con signo de Wilcoxon) y cambio (>1,2 o <0,83).Los datos de EM sin procesar de las características extraídas y los datos de EM corregidos con suero de referencia se muestran en Datos complementarios 1 y Datos complementarios 2, respectivamente.La anotación de picos se realizó en base a cuatro niveles definidos de identificación, incluidos los metabolitos identificados, los compuestos supuestamente anotados, las clases de compuestos supuestamente caracterizados y los compuestos desconocidos 22 .Según las búsquedas en bases de datos en Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), finalmente se seleccionaron compuestos biológicos con estándares validados coincidentes MS/MS o anotaciones de coincidencia exacta en mzCloud (puntuación> 85) o Chemspider como intermedios entre el metaboloma diferencial.Las anotaciones máximas para cada característica se incluyen en los Datos complementarios 3. Se utilizó MetaboAnalyst 5.0 para el análisis univariado de la abundancia de metabolitos normalizados por suma.MetaboAnalyst 5.0 también evaluó el análisis de enriquecimiento de la vía KEGG basado en metabolitos significativamente diferentes.El análisis de componentes principales (PCA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) se analizaron utilizando el paquete de software ropls (v.1.26.4) con normalización de pila y escalado automático.El modelo de biomarcador de metabolitos óptimo para predecir la malignidad de los nódulos se generó mediante regresión logística binaria con operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO, paquete R v.4.1-3).El desempeño del modelo discriminante en los conjuntos de detección y validación se caracterizó estimando el AUC con base en el análisis ROC según el paquete pROC (v.1.18.0.).El corte de probabilidad óptimo se obtuvo con base en el índice de Youden máximo del modelo (sensibilidad + especificidad – 1).Las muestras con valores menores o mayores que el umbral se predecirán como nódulos benignos y adenocarcinoma de pulmón, respectivamente.
Se cultivaron células A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) en medio F-12K que contenía FBS al 10%.Se insertaron secuencias cortas de ARN en horquilla (shRNA) dirigidas a SLC7A5 y un control no dirigido (NC) en el vector lentiviral pLKO.1-puro.Las secuencias antisentido de shSLC7A5 son las siguientes: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Los anticuerpos contra SLC7A5 (n.° 5347) y tubulina (n.° 2148) se adquirieron de Cell Signaling Technology.Se utilizaron anticuerpos contra SLC7A5 y tubulina en una dilución de 1:1000 para el análisis de transferencia Western.
La prueba de estrés glicolítico Seahorse XF mide los niveles de acidificación extracelular (ECAR).En el ensayo, se administraron secuencialmente glucosa, oligomicina A y 2-DG para probar la capacidad glucolítica celular medida por ECAR.
Las células A549 transfectadas con control no dirigido (NC) y shSLC7A5 (Sh1, Sh2) se sembraron durante la noche en placas de 10 cm de diámetro.Los metabolitos celulares se extrajeron con 1 ml de metanol acuoso al 80% enfriado con hielo.Las células de la solución de metanol se rasparon, se recogieron en un tubo nuevo y se centrifugaron a 15.000 xg durante 15 minutos a 4 °C.Recoger 800 l de sobrenadante y secar utilizando un concentrador de vacío de alta velocidad.Luego se analizaron los sedimentos de metabolitos secos para determinar los niveles de triptófano usando LC-MS/MS como se describió anteriormente.Los niveles celulares de NAD(H) en células A549 (NC y shSLC7A5) se midieron utilizando un kit colorimétrico cuantitativo de NAD+/NADH (#K337, BioVision) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Se midieron los niveles de proteína para cada muestra para normalizar la cantidad de metabolitos.
No se utilizaron métodos estadísticos para determinar preliminarmente el tamaño de la muestra.Estudios metabolómicos previos destinados al descubrimiento de biomarcadores15,18 se han considerado puntos de referencia para la determinación del tamaño y, en comparación con estos informes, nuestra muestra fue adecuada.No se excluyeron muestras de la cohorte de estudio.Las muestras de suero se asignaron aleatoriamente a un grupo de descubrimiento (306 casos, 74,6%) y a un grupo de validación interna (104 casos, 25,4%) para estudios de metabolómica no dirigidos.También seleccionamos al azar 70 casos de cada grupo del conjunto de descubrimientos para estudios de metabolómica específicos.Los investigadores estaban cegados a la asignación de grupos durante la recopilación y el análisis de datos de LC-MS.Los análisis estadísticos de datos metabolómicos y experimentos celulares se describen en las secciones respectivas de Resultados, Leyendas de figuras y Métodos.La cuantificación del triptófano celular, NADT y la actividad glicolítica se realizó tres veces de forma independiente con resultados idénticos.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el Resumen del informe de cartera natural asociado con este artículo.
Los datos de EM sin procesar de las características extraídas y los datos de EM normalizados del suero de referencia se muestran en Datos complementarios 1 y Datos complementarios 2, respectivamente.Las anotaciones máximas para características diferenciales se presentan en los Datos complementarios 3. El conjunto de datos LUAD TCGA se puede descargar desde https://portal.gdc.cancer.gov/.Los datos de entrada para trazar el gráfico se proporcionan en los datos de origen.Se proporcionan datos fuente para este artículo.
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Hora de publicación: 18-sep-2023